Кеп - це

Цей термін має також інші значення див. Кеп (значення).

Кеп (5'-кеп, кеп-структура) (від англ. Cap - шапочка) - один або кілька модифікованих нуклеотидів на 5'-кінці транскриптов. синтезованих РНК-полімераза II. З хімічної точки зору, кеп є 7-метілгуанозін, з'єднаний 5 ', 5'-трифосфатних містком з першим нуклеотидним залишком транскрипта. У вузькому сенсі під кепом розуміють саме 7-метілгуанозін. Крім того, перші два нуклеотиди транскрипта можуть метилірованої по 2'-O-положенню рибози. Кеп сприяє ефективному процесингу пре-мРНК, експорту мРНК з ядра, її трансляції та захисту від швидкої деградації [1] [2].

Типи кеп-структури і їх поширеність

Будова 5'-кінця кепірованной мРНК

У переважної більшості еукаріот 5'-кінець транскриптов, синтезованих РНК-полімераза II. ко-транскрипційно модифікується шляхом приєднання 7-метілгуанозіна, або кепа (див. малюнок). РНК-полімераза II синтезує все пре-мРНК, деякі малі ядерні РНК і малі ядерцеві РНК. Віруси. які пристосовані до життя в клітині, також можуть мати кепірованние РНК незалежно від того, синтезуються вони РНК-полімераза II або іншим ферментом [3]. Залежно від типу організму і типу РНК первісна кеп-структура може піддаватися подальшим модифікаціям, головним чином, метилированию [4].

Виділяють такі типи кепа:

кеп 0 (m 7 GpppNp, де N - будь-який нуклеотид) - це мінімальна кепірующая структура, яка представляє собою 7-метілгуанозін, з'єднаний 5 ', 5'-трифосфатних містком з першим нуклеотидом РНК [2]. Кеп 0 розпізнається фактором ініціації трансляції eIF4E [5];
кеп 1 (m 7 GpppNm2'-O p) відрізняється від кепа 0 метилированием першого нуклеотиду транскрипта по 2'-O положенню рибози;
кеп 2 (m 7 GpppNm2'-O pNm2'-O p) відрізняється від кепа 0 метилированием першого і другого нуклеотидів транскрипта по 2'-O положенню рибози;
кеп 4 (m 7 GpppNm2'-O pNm2'-O pNm2'-O pNm2'-O p);
2,2,7-тріметілгуанозіновий кеп (m 2,2,7 GpppNp)

Кеп 0 характерний для РНК рослин (а також вірусів рослин) і грибів. у тварин він зустрічається рідко. Для РНК тварин характерні кеп 1 і кеп 2, співвідношення яких в клітці залежить від виду організму. Віруси тварин також, як правило використовують кеп 1 або кеп 2. Цікаво, що в РНК вірусів тварин першим нуклеотидом після 7-метілгуанозіна зазвичай є пурин. який може бути додатково метилірованої по атомам азотистого підстави (наприклад, з утворенням N 6 -метіладенозіна). У клітинних ж мРНК першим нуклеотидом після кепа може бути будь-який з чотирьох, і він теж, як правило, додатково метилірованої. В цілому можна сказати, що чим більше високо організований організм, тим більше метильних груп міститься в його кеп-структурах [2]. Кеп 4 був виявлений у деяких найпростіших [6]. 2,2,7-тріметілгуанозіновий кеп характерний для малих ядерних РНК і служить сигналом до їх транспорту і / або утримання в ядрі [4].

механізм кепірованія

Кепірующіе ферменти

Будова молекули рибози. що показує положення 2', 3'і 5'- атомів вуглецю

Кепірованіе - перший етап процесингу РНК. Кепірованіе відбувається ко-траскріпціонно в ядрі. коли синтезується транскрипт досягає довжини 25-30 нуклеотидів [7]. Кепірованіе здійснюється трьома ферментами. РНК-тріфосфатазой, гуанілтрансферазой і 7-метилтрансферазою [8].

РНК-тріфосфатаза отщепляет γ-фосфатну групу від 5'-кінцевого нуклеотиду транскрипта. Амінокислотна послідовність РНК-тріфосфатаз істотно варіює серед еукаріот, і можна виділити принаймні два сімейства даних ферментів: РНК-тріфосфатази, залежні від бівалентних катіонів (характерні для найпростіших. Грибів і вірусів еукаріот), і РНК-тріфосфатази, незалежні від бівалентних катіонів ( характерні для тварин і рослин) [9]. У дріжджів Saccharomyces cerevisiae РНК-тріфосфатаза кодується власним геном Cet1. в той час як у ссавців синтезується біфункціональний фермент, який володіє і РНК-тріфосфатазной (N-кінцевий домен), і гуанілтрансферазной активністю (C-кінцевий домен). Гуанілтрансфераза (у дріжджів кодується геном Ceg1) здійснює перенесення залишку ГМФ з ГТФ на β-фосфатну групу 5'-кінцевого нуклеотиду транскрипта з формуванням структури GpppN. Ця реакція відбувається в два етапи з утворенням проміжного з'єднання фермент (лізил-N) -ГМФ. 7-метилтрансфераза у всіх організмів кодується окремим геном (Abd1 у дріжджів) [9]. Цей фермент каталізує перенесення метильної групи від S-аденозілметіонін на Gppp-РНК з утворенням m 7 Gppp-РНК.

Зв'язок кепірованія з транскрипцією

Ко-транскрипційних протікання процесу кепірованія забезпечується тим, що кепірующіе ферменти прямо пов'язуються з фосфорілірованним C-кінцевим доменом великої субодиниці РНК-полімерази II [10] [11]. С-кінцевий домен має унікальну еволюційно консервативну структуру: він складається з багаторазово повторюваних амінокислотних мотивів Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser [9]. Кілька киназ можуть фосфорилювати амінокислотні залишки в C-кінцевому домені. Перехід від ініціації транскрипції до ранньої елонгації супроводжується фосфорилюванням Ser-5 чинником транскрипції TFIIH [12]. В ході транскрипції кількість фосфорилированного Ser-5 знижується, і починає переважати фосфорілірованний Ser-2 [9]. Після фосфорилювання РНК-полімерази II по Ser-5 до транскрипционному комплексу приєднується негативний транскрипційні фактор DSIF (англ. DRB sensitivity inducing factor), який в свою чергу привертає другий негативний регулятор - NELF (англ. Negative elongation factor). Разом ці фактори тимчасово пригнічують подальше проходження транскрипції. Гуанілтрансферазний домен кепірующего ферменту ссавців має спорідненість до С-кінцевого домену РНК-полімерази II, фосфорильованій по Ser-5. У дріжджів з РНК-полімераза зв'язується гуанілтрансфераза Ceg1, яка потім привертає в комплекс РНК-тріфосфатазу Cet1. Крім того, гуанілтрансфераза зв'язується одночасно і з однією з субодиниць фактора DSIF. Зв'язування з фосфорильованій формою РНК-полімерази і з DSIF стимулює каталітичну активність гуанілтрансферази [13]. Описані взаємодії забезпечують проходження кепірованія незабаром після ініціації транскрипції і до того, як транскрипційний комплекс перейде до продуктивної елонгації. Вважається, що фосфорілірованний Ser-5 пропадає до того моменту, як транскрипт досягає довжини 500 нуклеотидів. До цього ж часу з транскрипційного комплексу диссоциируют і кепірующіе ферменти [12]. Важливо відзначити, що не тільки транскрипція визначає хід кепірованія, а й успішність процесу кепірованія впливає на подальший хід транскрипції (див. Нижче).

Кепірованіе 5'-кінця РНК-транскрипту багато в чому визначає його подальшу долю в клітці. Відомі такі функції кепа:

регуляція транскрипції;
участь в сплайсинге;
участь в процессинге 3'-кінця мРНК;
регуляція транспорту РНК між ядром і цитоплазмою;
захист транскрипта від деградації під дією екзонуклеаза;
стимуляція трансляції.

регуляція транскрипції

Вважається, що рух транскрипційного комплексу відзначено зниження факторами транскрипції DSIF і NELF, які діють в парі, і відновлюється під дією позитивного регулятора PTEFb, який фосфорилирует повторювані амінокислотні мотиви в С-кінцевому домені РНК-полімерази II по положенню Ser-2 [13]. Кількома групами дослідників було встановлено, що транскрипція генів у дріжджів стимулюється кепірующімі ферментами [18] [19] [20]. При цьому з'ясувалося, що дія цих ферментів на транскрипцію не змінюється, навіть якщо вони виявляються каталитически неактивними внаслідок мутацій. Цей факт дозволяє припустити, що саме по собі присутність кепірующіх ферментів в транскрипционном комплексі, а не обов'язково навіть кеп-структура, стимулює рух транскрипційного комплексу. Стимулююча дія кепірующіх ферментів на транскрипцію можна пояснити, по-перше, тим що вони здатні зв'язуватися з DSIF, витісняючи NELF з комплексу з ним, в результаті чого інгібуючий дію DSIF на транскрипцію припиняється [19]. По-друге, 7-метилтрансфераза (по крайней мере, в разі Schizosaccharomyces pombe і Caenorhabditis elegans) може залучати в транскрипції комплекс фактор транскрипції PTEFb, що сприяє початку просування комплексу всередину гена [21] [22]. Крім того, додаткове залучення PTEFb забезпечується кеп-зв'язуючим білковим комплексом (CBC) (див. Нижче) [23].

У той же час є дані, що транскрипція, по крайней мере, деяких генів дріжджів відбувається незалежно від кепірованія [13]. Тобто, по крайней мере, у дріжджів зв'язок кепірованія і транскрипції є геноспеціфіческой характеристикою. Подальші дослідження повинні показати, так це у випадку інших організмів.

Участь в сплайсинге

Кеп-структура стимулює сплайсинг пре-мРНК як in vitro. так і in vivo. причому більшою мірою стимулюється вирізання інтрона найближчого до 5'-кінця транскрипту [24] [25] [26]. Позитивна дія кепа на сплайсинг пояснюється наступним чином. Відразу після приєднання кепа до 5'-кінця транскрипту з ним зв'язується кеп-зв'язуючий комплекс CBC (англ. Cap binding complex), який важливий для подальших етапів процесингу пре-мРНК. CBC складається з двох субодиниць: кеп-зв'язує CBP20 (англ. Cap binding protein) і допоміжної CBP80 [27]. Кеп-зв'язуючий комплекс взаємодіє з одним з компонентів сплайсосома. мяРНП U1, і забезпечує його посадку на пре-мРНК недалеко від 5'-кінця. мяРНП U1 відповідає за розпізнавання 5'-кінцевого сайту сплайсингу, з нього починається наступна збірка сплайсосома [28]. Варто відзначити, що як і у випадку з транскрипцією, поки що точно не відомо, яка доля пре-мРНК, сплайсинг яких не залежить від наявності кепа, у різних організмів. У всякому разі, показано, що така залежність є геноспеціфіческой у S. cerevisiae [13].

Участь в процессинге 3'-кінця мРНК

3'-кінець мРНК еукаріотів формується в два етапи: спочатку особлива ендонуклеаза вносить розрив в 3'-кінцева ділянка мРНК, а потім полі (А) -полімераза приєднує до знову сформованого 3'-кінця полі (А) -хвост [29]. Наявність кепа стимулює ендопротеолітіческое розщеплення 3'-кінця мРНК в ядерних екстрактах клітин HeLa [30] [31]. Позитивна дія кепа в цьому випадку також здійснюється через кеп-зв'язуючий комплекс, який зв'язується з компонентами 3'-процесує комплексу і забезпечує його стабільність [32]. Чи впливає наявність кепа на ефективність поліаденілювання поки точно не встановлено.

Роль в транспорті РНК

Кеп грає важливу роль транспорті РНК з ядра. Експорт мРНК здійснюється за участю комплексу транспортних факторів Mex67-Mtr2 (у дріжджів) або TAP-p15 (у багатоклітинних) [33]. Однак цей комплекс зв'язується з мРНК не безпосередньо, а через адаптерний білок Yra1 (у дріжджів) або ALY / REF (у багатоклітинних), який є однією з субодиниць білкового комплексу TREX. У свою чергу, TREX залучається в комплекс з мРНК за рахунок прямої взаємодії ALY / REF з CBC80 субодиницею кеп-зв'язуючого комплексу [34]. Такий механізм забезпечує приєднання транспортного комплексу близько до 5'-кінця мРНК і відповідну спрямованість її транспорту, 5'-кінцем в сторону цитоплазми.

Малі ядерні РНК, синтезовані РНК-полімераза II, експортуються в цитоплазму на деякий час для подальшого дозрівання, після чого повертаються назад в ядро для виконання своїх функцій, при цьому кеп регулює їх транспорт в обох напрямках. мяРНК експортуються за участю транспортного білка Crm1, який, як і в випадку з мРНК, зв'язується зі своїм субстратом через адаптерний білок PHAX (англ. phosphorylated adaptor for RNA export) [35]. PHAX приєднується до мяРНК завдяки спорідненості до кеп-зв'язує комплексу. В ході формування мяРНП в цитоплазмі кеп-структура мяРНК піддається подвійному метилированию з утворенням 2,2,7-тріметілгуанозінового кепа [4]. Інший транспортний фактор, снурпортін 1, дізнається такий модифікований кеп і забезпечує транспорт мяРНП назад в ядро [36]. Ймовірно, що додаткове метилювання кепа також запобігає повторний або випадковий експорт РНК з ядра і / або їх повернення в ядро після мітозу.

Захист мРНК від деградації

Присутність кепа на 5'-кінці захищає молекули мРНК від швидкої деградації під дією екзонуклеаза двома способами [37] [2]. По-перше, 5'-екзонуклеаза не можуть розщеплювати 5 ', 5'-трифосфатних зв'язок між кепом і тілом мРНК. По-друге, кеп-зв'язуючі білки (наприклад, eIF4E-eIF4G) блокують доступ нуклеаз до 5'-кінця мРНК [4]. Відщеплення кепа (декепірованіе) є однією з ключових стадій в деяких шляхах деградації мРНК (див. Нижче).

Роль в трансляції

Після завершення процесингу мРНК слід своєрідний етап перевірки його якості. Завдяки процесу розщеплення мРНК, що містять передчасні стоп-кодони (англ. Nonsense-mediated decay (NMD)) клітина позбавляється від мРНК, на яких можуть синтезуватися укорочені і ймовірно нездатні виконувати свої функції білки. Зріла мРНК, яка як і раніше ще містить кеп-зв'язуючий комплекс CBC на 5'-кінці і інші білки, характерні для ядерних МРНП, втягується в перший пробний раунд трансляції. Якщо в ході трансляції виявляється присутність передчасного стоп-кодону, то така мРНК піддається деградації шляхом NMD. Якщо ж такого стоп-кодону не було, то відбувається заміна мРНК-зв'язуючих білків на характерні для цитоплазми (наприклад, PABP2 замінюється на PABP1, CBC - на eIF4E), і мРНК стає повноцінною матрицею для трансляції [38].

Велика частина мРНК еукаріотів транслюється по кеп-залежному механізму і тільки відносно невелика їх частка - за механізмом внутрішньої посадки рибосоми. Щодо давно вже було відомо, що некепірованние мРНК є поганими матрицями для синтезу білка в експериментах in vitro і що наявність кепа стимулює зв'язування мРНК з рибосомою [2]. На сьогоднішній день відомий молекулярний механізм такої дії кепа. Ініціація кеп-залежною трансляції включає етап збірки комплексу eIF4F (eIF4E-eIF4G-eIF4A) на кепірованном 5'-кінці мРНК. Першим до мРНК приєднується кеп-зв'язуючий фактор ініціації трансляції eIF4E, який привертає в комплекс більший білок eIF4G. eIF4G, в свою чергу, служить платформою для посадки інших білків: eIF4A, eIF3 і PABP. Дія цих та ще деяких інших білків готує мРНК для посадки 43S преініціаторного комплексу, що містить малу субодиницю рибосоми. Після цього слід сканування малої субодиницею рибосоми 5'-нетрансльовані області мРНК, починаючи з 5'-кінця, в пошуках стартового кодону та початок синтезу білка [39] [40].

Декепірованіе і рекепірованіе

Декепірованіе

Кеп поряд з полі (А) -хвостом забезпечує стабільність молекули мРНК, а відщеплення кепа веде до її деградації. Таким чином, декепірованіе є критичним моментом в життєвому циклі мРНК і строго регулюється в клітці [41].

Відомо кілька можливих шляхів деградації еукаріотичної мРНК [42]:

деградація, залежна від укорочення полі (А) -хвоста;
- 5 '→ 3' деградація;
- 3 '→ 5'-деградація;
деградація, не залежна від укорочення полі (А) -хвоста;
деградація за участю ендонуклеаз.

У разі залежною від укорочення полі (А) -хвоста деградації мРНК події можуть розвиватися за двома який не виключає одне одного сценаріями. Розщеплення в напрямку 5 '→ 3' починається з декепірованія мРНК під дією декепірующего білкового комплкекса. У S. cerevisiae цей комплекс складається з двох білків: каталітичної субодиниці Dcp2 (англ.) Рос. і ко-активатора Dcp1 (англ.) рос. У вищих еукаріот в цей комплекс входить третій білок, званий Hedls (у людини), який забезпечує додаткову зв'язок між субодиницями комплексу і стимулює декепірованіе [41]. Продуктами реакції декепірованія є 7-метил-ГДФ і РНК з монофосфатом на 5'-кінці. Такий 5'-кінець ставати доступним екзорібонуклеазе Xrn1 (англ.) Рос. яка руйнує мРНК в напрямку 5 '→ 3'. Білки, які беруть участь в 5 '→ 3' деградації мРНК, виявляються у великій кількості в тільцях процесингу (англ.) Рос. які розглядаються як можливе місце зберігання і / або деградації мРНК [42].

Руйнування мРНК в напрямку 3 '→ 5' каталізується великої мультісуб'едінічной екзонуклеаза - Екзосома (англ.) Рос. Кепірованний ди- або олигонуклеотид, який залишається після завершення роботи Екзосома, піддається декепірованію під дією ферменту DcpS (англ.) Рос. з утворенням 7-метил-ГМФ. DcpS також перетворює 7-метил-ГДФ, який утворюється при декепірованіі мРНК під дією декепірующего комплексу, в 7-метил-ГМФ [4].