Мікроскопічний метод діагностики інфекційних захворювань - студопедія
Мікроскопічний метод діагностики інфекційних захворювань включає приготування мазка, його забарвлення з використанням простих і складних методів забарвлення, проведення иммерсионной мікроскопії для вивчення морфологічних (форми і розташування) ітинкторіальних властивостей (відношення до барвнику) з метою ідентифікації до роду (Staphylococcus, Streptococcus) або сімейства (Епterobactericeae).
Першим етапом мікроскопічного методу є приготування мазка (рис. 6). Мазок виконують на чистому, знежиреному предметному склі, по поверхні якого крапля води повинна розтікатися рівномірно. Для очищення скла необхідно натерти його шматочком мила і видалити мило за допомогою марлевої серветки або протерти спиртом. Для приготування мазка на зворотному боці предметного скла маркують зону і наносять невелику краплю води або ізотонічного розчину хлориду натрію в якій розподіляють досліджуваний матеріал. Якщо мазок готують з рідкого досліджуваного матеріалу або мікроорганізмів, культивованих в рідкому поживному середовищі, беруть краплю рідини петлею і рівномірно розподіляють у позначеній зоні. Препарат висушують при кімнатній температурі на повітрі. Добре приготований тонкий мазок висихає рівномірно і швидко. Якщо ж висушування препарату сповільнене, то препарат підігрівають, тримаючи скло мазком догори, в потоці теплого повітря високо над полум'ям пальника. Це потрібно робити дуже обережно, не допускаючи перегрівання мазка, так як при цьому може статися дуже швидке і грубе згортання білків в протоплазмі мікробів, що порушить їх структуру. Якщо препарат висушений в повному обсязі, то при фіксації він виявиться також зіпсованим. Фіксація препарату проводиться з метою: 1) вбити мікробів і зробити безпечним подальше поводження з ними; 2) прикріпити (фіксувати) мазок до скла, щоб він не змивався при подальших маніпуляціях; 3) зробити мікробів більш сприйнятливими до фарбування, там як убиті мікробні клітини фарбуються краще, ніж живі.
Способи фіксації. Існує два основних способи фіксації: фізична (термічна) і хімічна (використання фіксаторів). У практичній бактеріології зазвичай застосовують фіксацію в полум'я пальника (фіксація жаром) - метод грубий, але зберігає морфологію і ставлення до барвників у бактерій. Для цього предметне скло в положенні мазком догори 3 рази (протягом 3-5 сек) проводять через найбільш гарячу частину полум'я пальника. У ряді випадків використовують рідкі фіксують розчини (етиловий і метиловий спирт, ацетон, формалін та ін.), Які запобігають ферментативний Аутоліз бактерій і стабілізують макромолекули шляхом їх хімічного зшивання, надаючи більш щадне дію. Для проведення хімічної фіксації препарати занурюють в розчин фіксує рідини на 5-20 хвилин. Вибір способу фіксації залежить від окрашиваемого препарату (рідкі фіксатори використовуються для мазків крові, гною та ін.) І методу забарвлення.
Мал. 6. Схема проведення мікроскопічного методу
7. Прості і складні методи забарвлення
Простий метод забарвлення. Є одноетапна і полягає в забарвленні мікропрепарату одним барвником. Використовують основні анілінові барвники, такі як, фуксин, генціанвіолет, метиленовий синій у вигляді водних розчинів або просочених барвником фільтрувальних папірців, які поміщають на мазок і змочують водою. Тривалість забарвлення становить 1-5 хвилин, після чого микропрепарат промивають водою, висушують і проводять мікроскопію. У препаратах, забарвлених простим методом, можна отримати уявлення про форму, розташування і розмірах мікробних клітин.
Складні методи забарвлення. Складні (диференційні) методи забарвлення (по Граму, Цілем-Нільсеном та ін.) Включають послідовне використання декількох барвників і додаткових способів обробки препаратів. Ці методи дозволяють диференціювати бактерії в залежності від будови їх структур, найчастіше поверхневих. Наприклад, метод забарвлення за Грамом дозволяє диференціювати бактерії за будовою їх клітинної стінки: грампозитивні (фіолетові) з товстої і грамнегативні (червоні) бактерії з тонкої клітинної стінкою.
Існують спеціальні складні методи забарвлення, які використовують для виявлення структурних компонентів бактеріальної клітини: капсул, цитоплазматических включень, суперечка, джгутиків.