Люмінесцентна (флюоресцентная) мікроскопія

Люмінесцентна (флюоресцентная) мікроскопія

Люмінесцентна (флюоресцентная) мікроскопія заснована на здатності деяких речовин люминесцировать, т. Е. Світитися при висвітленні невидимим ультрафіолетовим або синім світлом.
Колір люмінесценції зміщений в більш довгохвильову частину спектру в порівнянні з збудливим її світлом (правило Стокса). При порушенні люмінесценції синім світлом колір її може бути від зеленого до червоного, якщо люмінесценція збуджується ультрафіолетовим випромінюванням, то світіння може бути в будь-якій частині видимого спектру. Ця особливість люмінесценції дозволяє, використовуючи спеціальні світлофільтри, які поглинають збудливий світло, спостерігати порівняно слабке люмінесцентне свічення.
Пристрій люмінесцентного мікроскопа і правила роботи з ним відрізняються від звичайного світлового мікроскопа в основному наступним:

Наявність потужного джерела світла в освітлювачі, що вивчає переважно в короткохвильового (ультрафіолетової, синьою) частини спектра (ртутно-кварцова лампа надвисокого тиску або галогенна кварцова лампа).

Наявність системи світлофільтрів:

збуджуючі світлофільтри пропускають тільки ту частину спектра, яка збуджує люмінесценцію;

* Теплозахисний світлофільтр захищає від перегріву інші світлофільтри, препарат і оптику люмінесцентного мікроскопа. У деяких вітчизняних люмінесцентних мікроскопах теплозахисну функцію крім того виконує плоскопараллельнимі стеклами, дистильованою водою;

«Замикають» світлофільтри розташовані між окуляром. Ці світлофільтри поглинають збудливу випромінювання і пропускають світло люмінесценції від препарату до ока спостерігача.

У нашій країні розроблено ефективний спосіб освітлення препаратів для збудження люмінесценції, який полягає в тому, що препарат висвітлюють світлом, падаючим на нього через об'єктив. Завдяки цьому освітленість збільшується при використанні об'єктів, що мають велику числову апертуру, т. Е. Тих, які використовуються для вивчення мікроорганізмів. Важливу роль при цьому способі освітлення грає спеціальна интерференционная светоделітельная пластинка, яка спрямовує світло в об'єктив. Вона являє собою напівпрозоре дзеркало, яке вибірково відображає і направляє в об'єктив частина спектра, яка збуджує люмінесценцію, а пропускає в окуляр світло люмінесценції. Оптика об'єктивів люмінесцентного мікроскопа виготовляється з нелюмінесцірующіх сортів оптичного скла і склеюється спеціальним нелюмінесцірующіх клеєм. На оправі таких об'єктивів викарбувано буква «Л». При роботі з об'єктивами масляної імерсії використовується нелюмінесцірующіх іммерсійне масло.

Препарат риккетсий,
пофарбований за допомогою РІФ

Оскільки більшість мікроорганізмів не мають власної люмінесценції існує кілька способів їх обробки для спостереження в люмінесцентному мікроскопі. Перш за все це флюорохромірованіе - фарбування сильно розведеними (до декількох мікрограмів / мл) розчинами флюоресцирующих барвників (флюорохромів). Цей метод використовується для бактеріоскопічного дослідження збудників деяких інфекцій: туберкульозу (ауроміном). включень в клітинах, що утворюються деякими вірусами та ін. Цей же спосіб може застосовуватися для цитохимического вивчення живих і фіксованих мікроорганізмів: деякі флюорохромами вибірково зв'язуються з полімерами клітини (акридіновий помаранчевий зв'язуючись з ДНК флуоресціює зеленим, а з РНК - червоним.
В реакції іммуннофлюоресценціі за допомогою антитіл, мічених флюорохромами (ФИТЦ і ін.), Виявляються антигени мікроорганізмів або антитіла в сироватці хворих.