Вірусологія та біотехнологія (ветеринарія) - мікробіології і вірусології

Доп. матеріали

Культивувати віруси можливо тільки в живих клітинах. Для цього використовують будь-яку біологічну систему: тваринні організми, курячі ембріони, культури клітин. Раніше на початкових етапах розвитку вірусології широко застосовувалися для цих цілей організми лабораторних тварин (кроликів, морських свинок, білих мишей і щурів, золотистих хом'ячків) і часто - природно сприйнятливих чутливих до конкретного вірусу тварин і птахів (курей, голубів, поросят, щенят, кошенят і т.д.). При виборі лабораторних тварин необхідно виконувати наступні вимоги: - тварини повинні бути здорові. Новоприбулих в віварій містять в карантині (мишей і щурів 14 днів, інших - 21 день). Для виключення латентних (прихованих) інфекцій вірусної етіології, таких як ектромелія білих мишей, вірусні пневмонії, нейроінфекції, проводять метод контролю тварин на носійство збудників цих інфекцій. Суть його полягає в приготуванні суспензії з органів убитих з цією метою тварин і введення її тваринам віварію;
- тварини повинні бути чутливими до даного вірусу;
- вік тварини має велике значення: найбільш чутливі молоді та новонароджені, але в деяких випадках для виявлення яскравих клінічних ознак хвороби використовують дорослих тварин;
- тварини повинні бути одного віку і маси тіла; краще для цього підходять лінійні тварини, тобто отримані в результаті близькоспорідненого схрещування.

Вибір методу зараження визначається тропизмом вірусу, т. Е. Здатністю його репродукуватися в певних типах клітин організму. Розрізняють нейротропні віруси (вірус сказу, репродукується в нервових клітинах), дермотропні (репродукується в клітинах шкіри - вірус віспи), пневмотропні (в клітинах легенів), Політропний (репродукується в декількох типах клітин), пантропние (репродукується в усіх абсолютно клітинах). Знаючи тропізм вірусу, матеріал вводять в органи, що містять чутливі до цього вірусу клітки.

Віруссодержащего матеріал може бути введений різними методами, в кожному конкретному випадку вибирається найбільш прийнятний. Перед зараженням місце введення ретельно обробляють 3% спиртовим розчином йоду, при необхідності вистриг шерсть. Підшкірно заражають, піднімаючи шкірну складку в області спини, лопатки, колінної складки, шиї. Внутрішньошкірний метод полягає у введенні в товщу верхнього шару шкіри в плантарную поверхню задньої кінцівки в напрямку від пальців до гомілковостопного суглоба. Іноді застосовують втирання шпателем, щіточкою віруссодержащего матеріалу в скаріфіцірованную шкіру живота, внутрішньої поверхні стегна, ступні, гребінь або пір'яні фолікули гомілки. У м'яз стегна, груди заражають при внутрішньом'язовому введенні. Часто у мишей, щурів застосовують внутрішньочеревне зараження, фіксуючи при цьому тварина вниз головою. При внутрішньовенному зараженні мишей, щурів в бічну вену хвоста, морських свинок - в серці в районі мечоподібного відростка, кроликів - в крайову вену вуха, птахів - в подкрильцовой вену важливо контролювати, щоб у вену зі шприца не були бульбашки повітря. Перед інтраназальним зараженням тварин (крім кроликів), щоб уникнути чхання та розбризкування віруссодержащего матеріалу роблять глибокий ефірний наркоз. Інтрацеребрапьное зараження проводять рідше: білим мишам, кроликам, морським свинкам - проколюючи шкіру і череп в області зовнішнього краю очниць, щурам - через отвір трепанації. Залежно від методу введення, а також виду тварини, визначається обсяг заражающей дози. За зараженими тваринами після реєстрації встановлюють щоденні спостереження за зовнішнім виглядом, поведінкою, рухливістю, прийомом їжі і т. Д. Загибель окремих тварин в першу добу може вважатися неспецифічної.

На наявність вірусу в матеріалі вказують три ознаки: симптоми хвороби, патологоанатомічні зміни і загибель. Слід враховувати, що не завжди при зараженні виявляються дані симптоми, а такі пасажі називають «сліпими». Наприклад, вірус, що міститься в патологічному матеріалі від коня, не здатний легко з першого разу розмножуватися в організмі білих мишей. В цьому випадку суспензією з матеріалу від першого пасажу проводять повторне, іноді неодноразове зараження тварин того ж виду.
Віруси, для виявлення і виділення яких використовують природно сприйнятливих тварин, не потребують попередньої адаптації і виявляють себе в біопробі певними ознаками вже на першому пасажі.
Поява видимих ​​змін в стані і функціонуванні організму після експериментального зараження вважають непрямим доказом розмноження вірусу і вказують на те, що в досліджуваному організмі містився вірус. Враховують при цьому тривалість інкубаційного періоду, характерного для певної хвороби. Нерідко захворювання закінчується загибеллю, що теж є ознакою розмноження вірусу в організмі. При розтині видимі зміни кольору, розміру, форми, консистенції органів і тканин також вказують на розмноження вірусу в організмі. Отриманий від реагував тваринного віруссодержащего матеріал вважають виділеним вірусом. Для визначення видової приналежності виявленого вірусу його необхідно ідентифікувати за допомогою серологічних реакцій. При цьому матеріал з невідомим антигеном отримують при розтині зараженої тварини.

Під титром вірусу розуміють вираз його концентрації в матеріалі. Титр вірусу - це кількість вірусу, що міститься в одиниці об'єму матеріалу. У вірусологічної роботі при експериментальному зараженні або виробництві та оцінці активності противірусних та діагностичних препаратів постійно виникає необхідність визначення кількості вірусів в тому чи іншому матеріалі. Кількість вірусу висловлюють в одиницях дії або одиницях активності.

Віруси мають інфекційних та гемагглютинирующих дією. Звідси і одиниці кількості вірусів інфекційні та гемагглютинирующие. У практиці використовують три типи одиниць кількості вірусу:
1. Інфекційні одиниці локальних пошкоджень, що викликаються вірусами і оцінюються за одиничного ефекту.
2. Інфекційні одиниці 50% дії вірусів на чутливі живі об'єкти, які оцінюються статично.
3. гемагглютинирующих одиниці.

З локальних пошкоджень, що викликаються вірусами, найбільш відомі бляшки (острівці мертвих, які не забарвлених клітин в шарі забарвлених живих) в заражених культурах клітин, залитих агаровим середовищем з барвником нейтральрот і оспини (некротичні вузлики) на ХАО курячих ембріонів, заражених оспеннимі і деякими іншими вірусами .
Кількість вірусу при цьому може бути виміряна, відповідно, в бляшкообразуюшіх одиницях (БОЮ) і оспообразующіх одиницях (оое): 1 БОЮ = доза вірусу, яка викликала утворення однієї бляшки; 1 оое = доза вірусу, яка викликала утворення однієї оспини. Методика визначення титру вірусу в БОЮ (оое) полягає в наступному:
1. Точно відміряними і строго однаковими обсягами досліджуваного віруссодержащего матеріалу заражають кілька культур клітин в матрацах або курячих ембріонів на ХАО.
2. Підраховують кількість які утворилися в кожному матраці бляшок або в кожному курячому ембріоні віспинами.
3. Розраховують середнє арифметичне цієї кількості, яка дорівнює кількості БОЮ або оое вірусу в заражающей дозі віруссодержащего матеріалу.
4. Титр вірусу (Т) розраховують за формулою:
Т = середнє арифметичне кількість бляшок (віспинами) / обсяг заражающей дози х розведення віруссодержащего матеріалу.
Вважається, що рахунком піддаються бляшки і оспини, якщо їх кількість не перевищує 50 на матрац або ХАО. Іноді, в разі високої концентрації вірусу в матеріалі, бляшки в культурі клітин або оспини на ХАО можуть зливатися, і їх неможливо буде порахувати. У таких випадках готують кілька десятикратних розведень досліджуваного матеріалу і кожним розведенням в однакових дозах заражають рівні групи культур клітин або курячих ембріонів, потім розраховують середнє арифметичне кількість бляшок або віспинами для кожного розведення. Титр вірусу в цьому випадку розраховується за більш складною формулою:
Т = сума середніх арифметичних кількості бляшок (віспинами) в кожному розведенні / обсяг заражающей дози х суму розведень віруссодержащего матеріалу
Метод титрування вірусів в БОЮ дає найбільш достовірні дані про концентрацію вірусів, але він зустрічає технічні труднощі з підрахунком бляшок. Що стосується віспинами, то їх використання обмежується досить нечисленними вірусами, здатними утворювати вузлики на ХАО курячих ембріонів.

Цей метод більш універсальний. Кількість вірусу (титр вірусу) при цьому вимірюється в ефективній 50% дозі - ЕД50.
1 ЕД50 = доза вірусу, здатна викликати інфекційний ефект у 50% заражених тест-об'єктів.
Для кожного вірусу підбирають чутливий до нього тест-об'єкт - лабораторні тварини (зазвичай білі миші), курячі ембріони або культура клітин. Інфекційний ефект або дію вірусу на різних тест-системах може проявлятися загибеллю, клінічними симптомами, патолого змінами і цитопатическим ефектом. У лабораторних тварин і курячих ембріонів дію вірусу оцінюється в летальної і інфекційної дозах:
1 ЛД50 - доза вірусу, що вбиває 50% лабораторних тварин;
I ЕЛД50 - доза вірусу, що вбиває 50% курячих ембріонів;
1 ІД50 - доза вірусу, що викликає клінічні симптоми або патологоанатомічні зміни у 50% заражених лабораторних тварин;
1 ЕІД50 - доза вірусу, що викликає патологоанатомічні зміни у 50% заражених курячих ембріонів.
У культурі клітин дію вірусу оцінюється по цитопатичної ефекту або дії (ЦПД):
1 ЦПД50 - доза вірусу, що викликає цитопатичної ефект в 50% пробірок із зараженою культурою клітин.
Кількість ЕД50 (ЛД50, ЕЛД50, ІД50, ЕІД50 і ЦПД50) вірусу, що міститься в одиниці об'єму віруссодержащего матеріалу, буде вираженням титру вірусу в цьому матеріалі. Так, запис Т = 103.48 ЦПД50 / 0,1 мл означає, що в кожному 0,1 мл віруссодержащего матеріалу міститься 103.48 доз (3020), кожна з яких здатна викликати цитопатичної ефект в 50% пробірок з культурою клітин.

Деякі віруси при певних умовах здатні агглютинировать еритроцити певних видів тварин. Титр таких вірусів можна виразити в гемагглютііірующіх одиницях (Гаї).
1 Гаї = доза вірусу, здатна агглютинировать близько 50% еритроцитів, що містяться в тому ж, що і вірус, обсязі 1% суспензії відмитих еритроцитів.
Методика визначення титру вірусу по гемагглютинирующих дії така:
1) готують 1% суспензію відмитих еритроцитів тварин певного виду;
2) готують ряд послідовних 2-кратних розведень досліджуваного віруссодержащего матеріалу в плексігласовий пластинах в рівних обсягах;
3) до всіх разведениям віруссодержащего матеріалу додають 1% суспензію відмитих еритроцитів в таких же обсягах;
4) суміші витримують визначений час при певній температурі і оцінюють інтенсивність гемагглютііаціі в кожній лунці (пробірці) в хрестах. Те найвище розведення віруссодержащего матеріалу, з яким агглютинирует 50% еритроцитів (не менше ніж на два хрести), містить 1 Гаї.
Титр вірусу буде більше у стільки разів, у скільки разів розлучений матеріал, щоб отримати 1 Гаї. Якщо вищим розведенням, що дає гемаглютинацію на два хреста, буде 1: 128, це означає, що в обсязі титрування вірусу, розведеного в 128 разів, міститься 1 Гаї. В цьому випадку титр вірусу в нерозведеному матеріалі дорівнює 128 Гаї.

Антитілами називаються білки, що утворюються в організмі теплокровного тварини у відповідь на парентеральне введення високомолекулярних речовин з ознаками генетичної чужорідність для даного організму. Речовини, на введення яких утворюються антитіла, називаються антигенами. Віруси в переважній більшості є антигенами. Антитіла здатні вступати у взаємодію з тим антигеном, у відповідь на який вони утворилися (специфічність антитіл), і нейтралізувати його біологічну активність. Таким чином, антитіла захищають організм від інфекційних агентів, в цьому і полягає біологічний сенс їх утворення. Антитіла можуть взаємодіяти з гомологічними антигенами не тільки in vivo, а й in vitro.

Принцип РГГА полягає в тому, що в пробірці змішують рівні об'єми сироватки крові і суспензії вірусу і після експозиції визначають, чи зберігся в суміші вірус шляхом додавання суспензії еритроцитів. Аглютинація еритроцитів вказує на наявність вірусу в суміші. Відсутність гемаглютинації означає, що вірус нейтралізований антитілами і тому втратив здатність агглютинировать еритроцити.
Але антитіла з антигенами взаємодіють в суворо визначених кількісних співвідношеннях. Тому, для того щоб певна кількість вірусу було позбавлене гемагглютинирующей здатності, потрібен певний мінімум антитіл, а так як один з компонентів РГГА завжди невідомий, доводиться реакцію ставити в ряду пробірок з різними дозами антитіл і однаковими дозами вірусу або навпаки. Це досягається тим, що беруть або різні розведення сироватки і один і той же розведення вірусу, або різні розведення вірусу і одне і те ж розведення сироватки.
РГГА дозволяє вирішувати наступні завдання:
- визначати титр антитіл до гемагтлютінірующему вірусу в сироватці;
- ідентифікувати невідомий гемагглютініруюшій вірус по відомим сироватка;
- встановити ступінь антигенного спорідненості двох вірусів.
Переваги РГГА: простота техніки, швидкість, не потрібно стерильною роботи, специфічність, дешевизна. Недолік: РГГА можлива тільки з гемагглютініруюшімі вірусами.

Принцип титрування антитіл в РГГА полягає в наступному:
- готують ряд послідовних (зазвичай 2-кратних) розведень досліджуваної сироватки в однакових обсягах (чаші по 0,25 або 0,2 мл);
- до кожного розведення додають такі ж обсяги гомологичного вірусу в титрі 4 Гаї;
- суміші витримують певний час при певній температурі (для вірусу ньюкаслської хвороби 40-60 хв при кімнатній температурі);
- до всіх сумішей додають рівні об'єми 1% суспензії відмитих еритроцитів;
- після експозиції оцінюють гемаглютинацію в кожній суміші в хрестах.
В реакції передбачаються контролі сироватки, вірусу і еритроцитів.
Те найвище розведення сироватки, яке ще повністю гальмує гемагглютінаіію. приймається за показник титру антитіл в цій сироватці.