Техніка виготовлення гістологічних препаратів
Виготовлення гістологічних препаратів включає: 1) фіксацію матеріалу; 2) приготування гістологічних зрізів; 3) фарбування зрізів.
ФІКСАЦІЯ МАТЕРІАЛУ
Загальні відомості. Сутність фіксації полягає в тому, щоб зберегти взяті шматочки органів і тканин від гниття і ферментативних процесів, що змінюють структуру тканин.
Фіксуються тканини зазнають ряд фізико-хімічних змін. Найбільш істотними з них є: швидке згортання білків і частково липоидов і перехід їх в такий стан, при якому тканини не змінюються від тривалого зберігання і під час наступних обробок.
Фіксацію тканин виробляють в рідинах різного складу. Найбільш уживаними є формалін, спирт, рідше ацетон, сулема та ін.
Фіксація формаліном. Продажний формалін (40% -ний водний розчин формальдегіду) застосовується в 10% -ному, 15% -ому розчині (10,0-15,0 продажного формаліну на 90,0-85,0 води). Формалін у зазначеній концентрації порівняно швидко (48- 72 год) просочує тканину і добре фіксує її. Не можна фіксувати матеріал в розчині формаліну більш високої концентрації або в нерозведеному продажному формаліні. В цьому випадку поверхневі шари тканини швидко ущільнюються, утворюють скоринку, яка перешкоджає проникненню фіксує рідини всередину, де процеси аутолізу можуть тривати.
У зв'язку з тим, що в формаліні завжди міститься якась кількість мурашиної кислоти, яка може негативно вплинути на тканину і перешкодити деяким методам подальшої обробки матеріалу (сріблення і ін.) Його слід нейтралізувати крейдою. На 100 г продажного формаліну (40% -ний розчин формальдегіду) додають Південь крейди. Вміст кілька разів збовтують, потім дають відстоятися, поки крейда осяде на дно посуду. Слід також мати на увазі, що при зберіганні формаліну в холодному приміщенні формальдегід здатний до .полімерізаціі і випадання з міцних розчинів у вигляді білих опадів. З метою попередження цього рекомендують зберігати формалін в теплому приміщенні, в темному посуді.
Шматочки тканини, взяті для гістологічного дослідження, не повинні бути товщі 0,5-0,7 см. Щоб шматочки тканини не прилягали щільно до стінок банки, їх кладуть на вату або фільтрувальний папір. Обсяг фіксує рідини повинен перевищувати приблизно в 10 разів обсяг взятого матеріалу. Фіксація водним розчином формаліну небажана в тих випадках, коли дослідження тканини має на меті виявлення речовин, розчинних у воді.
У випадках, коли потрібне швидке дослідження, шматочки тканини фіксують у формаліні, нагрітому до 85-90 ° С. Тривалість фіксації шматочків товщиною 2-3 мм при такій температурі 10-15хв. При тривалому зберіганні матеріалу; у формаліні в фіксується тканини утворюються темно-бурі опади, які забруднюють препарати. Для видалення опадів рекомендується опускати гістологічні зрізи в 2-3% -ний розчин перекису водню або в 1% -ний розчин їдкого калі, потім їх декілька разів промивати водою.
Фіксація спиртом. Цей метод доцільний тільки в тих випадках, кргда необхідно зафіксувати в тканинах речовини, розчинні у воді і водних розчинах фіксаторів. Для фіксації застосовують спирт 95 або 100 °. Спирт, витягуючи воду зі шматочків тканини, сам розбавляється і робиться менш міцним. Тому рекомендується міняти спирт кілька разів. Шматочки тканини при фіксації спиртом повинні бути товщиною 2-3 мм. У зимовий час рекомендується застосовувати спирт-формалін (спирту 70 ° -90,0, формаліну 10,0).
Приготування гістологічних зрізів
Загальні відомості. Для виготовлення гістологічних зрізів фіксована тканину потребує додаткового ущільнення. Для цього існує кілька методів: заморожування тканини, просочування її целлоидин, парафіном і т. П.
Після фіксації і ущільнення тканини тим чи іншим способом готують зрізи. Для отримання тонких
Зрізів однакової товщини, придатних для макроскопічного дослідження, користуються особливими апаратами мікротомів. Їх існує кілька типів. Найбільш вживаними є заморожують і санні мікротоми (рис. 137). Принцип пристрою їх полягає в тому, що після кожного зрізу столик, до якого прикріплена досліджувана тканина, піднімається на задану висоту. Таким чином, зрізи виходять однакової товщини. Зріз повинен бути досить тонким і прозорим, зазвичай виготовляють зрізи товщиною від 4 до 15 м> км. Заморожування тканини. При виготовленні гістологічних препаратів тканину заморожують на заморожувати мікротому, застосовуючи рідку вуглекислоту, ефір, хлоретилен, або за допомогою електричного струму на столику з напівпровідників.
Шляхом заморожування тканини вдається досить швидко виготовити гістологічні препарати. Цей метод використовується також при дослідженні тканин на відкладення в них жиру і жиросодержащих речовин, оскільки жири розчиняються в спиртах, ксилоле і ацетоні.
Заливка тканини в целлоидин. Для заливки препаратів в целлоидин вирізають шматочки тканини товщиною 1-3 мм і послідовно проводять через спирти зростаючої фортеці - 50, 75, 95 і 100 °, витримуючи по 24 год в кожному. Через спирт фортецею 100 ° шматочки тканини рекомендується проводити двічі, витримуючи по 24 год кожен раз. Потім шматочки тканини переносять в суміш рівних частин абсолютного (100 °) спирту і ефіру також на 24 год. Після цього шматочки тканини поміщають спочатку в 2% -ний, а потім 8% -ний розчин целлоидин на 2-3 дня в кожен.
Целлоидин готують з кіно - або фотоплівки. Спочатку її відмивають від желатин у гарячій воді, потім просушують, дрібно нарізають і розчиняють в суміші з рівних частин спирту і ефіру. 2% -ний розчин целлоидин по консистенції схожий з рідким колодієм, а 8% -ний нагадує густий сироп. Після витримки в густому целлоидин шматочки тканини заливають цим же целлоидин в чашечці під ковпаком, де він ущільнюється протягом 12-24 ч. Коли целлоидин придбає щільність еластичної гуми, вирізають блоки і наклеюють їх целлоидин на квадратні дерев'яні кубики. Можна заливати шматочки тканини целлоидин безпосередньо на кубиках. ВЛОК необхідно маркувати, для чого на одній з бічних поверхонь кубика роблять тушшю відповідне позначення. Зазвичай пишуть номер дослідження.
Зберігають шматочки, залиті в целлоидин, в 70 ° спирті. Заливка тканини в парафін. Зневоднення тканини виробляють в спиртах висхідної фортеці в тому ж порядку, як і при; целлоідіновой проводці. Після витримки шматочків досліджуваної тканини в 100 ° спирті їх переносять в суміш рівних частин абсолютного спирту і ксилолу на 2-3 ч. Потім шматочки тканини заливають чистим ксилолом і витримують протягом 2 - 3 ч. Після закінчення зазначеного терміну їх переносять в новий чистий ксилол на 2-3 ч, потім в парафін-ксилол (насичений розчин парафіну в ксилолі при 30 ° С) на 1 -1,5 год. Після цього шматочки тканини поміщають в чистий; парафін при температурі 54- 56 ° С на 1,5-2 ч. Потім їх заливають парафіном в паперові або металеві формочки і охолоджують у воді. Ущільнені шматочки тканини, так само як і целлоідіновие блоки, наклеюють на дерев'яні кубики і маркують.
ФАРБУВАННЯ зріз
Загальні відомості. Забарвлення гістологічних зрізів заснована на неоднакове спорідненість тканинних елементів до певних барвників. Ядра клітин більш здатні забарвлюватися основними, а цитоплазма - кислими фарбами. Відповідно до цього розрізняють основні, або ядерні, і кислі, або дифузні, фарби.
Найбільш часто в звичайній ветеринарної патологоанатомічної практиці застосовуються забарвлення зрізів гематоксилін-еозином по Ван-Гизону, Перлсу, Суданом III і ін.
Забарвлення гематоксилін-еозином. Фарбують зрізи в маленьких чашках Петрі або на стеклах. Цей метод застосовується для забарвлення зрізів, приготованих будь-яким способом. При цьому ядра клітин набувають фіолетово-синій або густо-синій колір, а цитоплазма і волокнисту речовину - світло-синій або рожево-червоний. Жири та липоиди не фарбується. Еритроцити ссавців, оскільки вони ядер не містять, фарбуються тільки еозином.
Забарвлення зрізів в чашках Петрі роблять у такий спосіб.
1. Зріз переносять препаровальной голкою з води в розчин гематоксиліном на 2-5 хв.
2. Промивають у воді 2-5 хв.
3. Занурюють на 10-20 с в 1% -ний розчин соляної кислоти на 70 ° спирті (якщо зріз сильно перефарбований гематоксилином, його слід тримати в цьому розчині трохи довше).
4. Промивають в чистій воді 5-10 хв.
5. Промивають в слабощелочном розчині (в баночку з водою додають 1-2 краплі нашатирного спирту) 10 хв.
6. Промивають знову чистою водою протягом 10- 15 хв. Якщо зріз після лужної води недостатньо промитий, він погано опитується еозином.
7. Фарбують еозином протягом 3-5 хв.
8. Промивають протягом 1-2 хв водою. 280
9. Зневоднюють в спиртах висхідної фортеці-75, 90, 100 °. Якщо зріз перефарбований еозином, його слід трохи довше тримати в 75 ° спирті.
10. просвітлювати в карболксілоле.
11. За допомогою шпателя і голки зріз переносять на предметне скло.
12. Висушують фільтрувальним папером.
13. На зріз наносять краплю канадського або пихтового бальзаму і накривають покривним склом.
Забарвлення по Ван-Гизону. У зрізах, забарвлених по Ван-Гизону, сполучна тканина фарбується в яскраво-червоний, інші тканини - в жовтий або сірувато-жовтий колір. Ядра фарбуються в чорний або темно-фіолетовий колір.
Забарвлення роблять у такий спосіб.
1. Зрізи інтенсивно фарбують гематоксиліном (краще гематоксилин Вейгерта) і споліскують у воді.
2. Відразу переносять в пикрофуксином на 3-5 хв (суміш насиченого водного розчину пікринової кислоти-150,0 і насиченого водного розчину кислого фуксину - 3,0-5,0).
3. Швидко промивають у воді (вода витягує з зрізу фуксин).
4. Зневоднюють 95 ° спиртом 1-2 хв.
5. просвітлювати в карболксілоле і укладають у смерековий бальзам, як при фарбуванні гематоксилін-еозином.
Забарвлення Суданом III. Судан III - нейтральна азокраска, розчинна в спирті, ацетоні і жирах, що не розчинна у воді. Забарвлення Суданом III виробляють для визначення в зрізах жирів і ліпідів. Техніка забарвлення наступна.
1. Заморожені зрізи переносять ізводи на 0,5- 1 хв в 50 ° спирт.
2. Зрізи поміщають в свежефільтрованний розчин Судану на 10-20 хв.
3. споліскують 50 ° спиртом протягом 0,5-1 хв.
4. Ретельно промивають водою протягом 10 - 15 хв.
5. Зрізи підфарбовують галуновим гематоксилином Ерліха або Бемера.
6. Промивають водою протягом 3-5 хв. Перефарбовані в гематоксиліном зрізи диференціюють
В 1% -ному водному розчині соляної кислоти, споліскують підлуженою водою, потім чистою водою.
7. Укладають в гліцерин або гліцерин-желатину.
8. Накривають покривним склом. Забарвлення по Перлсу. Цей спосіб забарвлення застосовують для виявлення в тканинах гемосидерину.
1. З дистильованої води зрізи переносять скляними голками на 15-20 хв в свежеприготовленную суміш, що складається з однієї частини 2% -ного розчину жовтої кров'яної солі і півтори частин 1% -ного водного розчину соляної кислоти.
2. Промивають дистильованою водою протягом 5-10 хв.
3. дофарбовував галуновим карміном 15-20 хв.
4. Обполіскують в воді і проводять через спирти, карболксілол і бальзам.
Железосодержащий пігмент - гемосидерин - набуває синювато-зеленуватий або блакитний колір.
Забарвлення по Туревич. За способом Туревич забарвлюють зрізи, виготовлені з мозку, для діагностики сказу. При цьому тільця Бабеша - Негрі і еритроцити фарбуються фуксином в червоний колір, нервові клітини гематоксилином - в синій.
Для гістологічного дослідження беруть шматочки Амона роги і мозочка, фіксують їх в 10% -ному формаліні, ацетоні або рідини Адуцкевіча наступного складу: 80% -ної оцтової кислоти - 1 частина, хлороформу -2 частини, 96 ° етилового спирту - б частин.
Тривалість фіксації при кімнатній температурі в формаліні 1 добу, в ацетоні і рідини Адуцкевіча - 3-6 ч. Після фіксації вирізають шматочки товщиною не більше 1 -1,5 мм, заливають в парафін, після чого готують гістологічні зрізи, висушують і фарбують.
Забарвлення по Туревич роблять у такий спосіб.
1. Зрізи перед фарбуванням депарафініруют в ксилолі 10-20 хв.
2. Змивають спиртом.
3. Фарбують ядра клітин гематоксилином Вей-герта протягом 2 хв.
4. Зрізи промивають водою.
5. Додатково фарбують 1% - ним розчином
Кислого фуксину протягом 1 хв.
6. Промивають водою.
7. Диференціюють в суміші 95 ° спирту і насиченого водного розчину пікринової кислоти протягом 10-20 с до ясно-жовтого відтінку.
8. висушують фільтрувальним папером.
9. Зневоднюють абсолютним спиртом.
10. просвітлювати в ксилолі протягом 1 хв.
11. Укладають в канадський, або смерековий, бальзам.
Мал. 137. Загальний вигляд заморожує мікротома:
/ - шланг для подачі вуглекислоти;