Рекомбінантні (химерні) ДНК - біологія

Читати далі: Визначення нуклеотидної послідовності (секвенування) ДНК

1. Рекомбінантні (химерні) ДНК

Створювані генними інженерами рекомбінантні ДНК називають химерними. Вони були створені для найрізноманітніших цілей, в тому числі і для целенаправленого впливу на ВІЛ. В останні роки число наукових робіт в цьому напрямку дуже велике. Одна з випробуваних схем з використанням химерних ДНК полягала в наступному. До гену, що кодує білок-рецептор CD4. "Підшили" інший ген, який забезпечує синтез рослинного білка рицину. Рицин ще в середні століття використовувався в якості сильної отрути. Потрапляючи в клітину, він блокує синтез білка в цитоплазмі, тим самим вбиваючи її. Після внесення в клітини такої рекомбінантної ДНК в кінцевому підсумку відбувається утворення кодованого їй химерного білка. Та його частина, яка відповідає білку-рецептора, забезпечує строго специфічне зв'язування химери з клітинами, на поверхні яких міститься вірусний білок CD4. Інша ж являє собою отруту рицин і знищує клітини, з якими зв'язується химерна молекула. Таким чином, одна частина химери забезпечує спрямований пошук в організмі клітин, заражених вірусом, а інша її частина вбиває їх. Схема досить проста і ефективна. Як "вбивці" можна використовувати не тільки ген рицину, а й деякі інші гени.

Інший підхід до боротьби з ВІЛ-інфекцією заснований на здатності деяких вірусних білків (Tat і Rev), надзвичайно важливих для розмноження ВІЛ в клітинах, специфічно зв'язуватися з певними ділянками молекули вірусної РНК. Для того, щоб запобігти цьому життєво важливий процес, було запропоновано вводити в інфіковані клітини штучно синтезовані РНК, що містять ділянки зв'язування з вірусними білками. Вірусного білку все одно, з чим зв'язуватися - з вірусної РНК або точно такий же "копією", сконструйованої искусствено. Додана в клітку в великій кількості, "копія" грає в даному випадку роль "пастки": якщо її багато, білок вірусу буде зв'язуватися переважно з нею, а не з РНК вірусу, і, в результаті цього, ВІЛ перестане розмножуватися.

Теоретично описані підходи виглядають дуже привабливо. І, як показали проведені випробування, в ізольованих клітинах вони працюють дуже добре. Однак немає надійних способів доставки і забезпечення довгого функціонування химерних "конструктів" в цілому організмі.

Нещодавно з'явилося повідомлення про створення ще однієї "химери" проти ВІЛ на основі антиретровірусного препарату енфервіртід.

Енфервіртід є короткий фрагмент білка gp41 ВІЛ. який, незважаючи на те, що він ніби як "рідний", перешкоджає вірусу "зливатися" з кліткою. На основі ретровірусу мишей сконструювали химерний вірус, який здатний в клітинах людини виробляти такий короткий фрагмент білка ВІЛ і "виставляти" його на поверхні клітин, заражених химерним вірусом. В результаті ВІЛ не може проникати в клітини навіть при наявності в них усіх рецепторів і корецепторів. Таким чином, фрагмент вірусного білка виступає в якості "щита" проти цілого вірусу. Дуже важливо, що захист спрацьовує на самому початковому етапі інфікування клітини. Адже коли вірус вже проник в неї, з ним боротися практично неможливо. Розпочаті в клініці випробування нової "химери", за твердженням дослідників, дали дуже обнадійливі результати.

2. Конструювання рекомбінантних ДНК

Під рекомбінантними розуміють ДНК, утворені об'єднанням in vitro (у пробірці) двох або більше фрагментів ДНК, виділених з різних біологічних джерел. Ключовими в цьому визначенні є слова "фрагмент ДНК" і "об'єднання in vitro", що вказує на сутність генетичної інженерії та її відмінність від всіх інших методів отримання гібридних (або химерних) організмів, таких як генетична селекція, ембріональна інженерія і т.д.

Фрагменти ДНК, в тому числі і фрагменти, що містять гени, отримують з використанням ферментів рестриктаз. Рестріктази можуть утворювати фрагменти як з тупими, так і з липкими кінцями. Зшивання фрагментів ДНК проводиться трьома основними методами, які залежать від того, які кінці мають фрагменти зшиваються ДНК.

Зшивання по однойменною "липким" кінців (рестріктазного лігазну метод)

Цей метод є найпоширенішим і популярним. Вперше цим способом гібридна ДНК була отримана С. Коеном з співробітниками в 1973 році. Деякі рестріктази, наприклад Pst I, вносячи в ланцюзі ДНК симетричні, розташовані навскіс один від одного розриви на рівних відстанях від центру сайту впізнавання і утворюють "сходинку" (рис. 36). Ці комплементарні один одному ділянки мають тенденцію до асоціації за рахунок спарювання підстав, і тому їх називають комплементарними або липкими кінцями. Парування підстав відбувається тільки між комплементарними послідовностями, тому ААТТ-кінці, утворені Eco RI, що не будуть спаровуватися, наприклад, з АГЦТ-кінцями, утвореними Hind III. Але будь-які два фрагмента (незалежно від їх походження), що утворилися під дією однієї і тієї ж рестріктази, можуть злипатися за рахунок утворення водневих зв'язків між однониткових ділянками комплементарних нуклеотидів (рис. 39).

Однак після такого спарювання повної цілісності подвійної спіралі не відновиться, оскільки залишиться два розриву в фосфодіефірнимі кістяку. Для його відновлення, тобто зшивання, або лігування ниток використовують фермент ДНК-лігази. Цей фермент в живій клітині виконує ту ж функцію - зшивання фрагментів ДНК, що синтезуються при реплікації.

Зшивання по "тупим" кінців (коннекторние метод)

Липкі кінці не абсолютно необхідні для зв'язування фрагментів ДНК. Тупі кінці також можуть бути з'єднані за рахунок дії ДНК-лігази, якщо і лігаза, і тупі кінці присутні в реакційній суміші в високих концентраціях. У цьому випадку реакція лигирования має свої особливості і її ефективність нижче, ніж при зшивці по липким кінців. Вперше такі експерименти були виконані в 1972 році Полем Бергом в Стенфордському університеті, США. Липкі кінці також можна ферментативним шляхом приєднати до молекул ДНК з тупими кінцями. Для цього використовують фермент - кінцеву трансферазу з тимуса теляти, яка приєднує нуклеотиди до 3-кінців ланцюгів ДНК. Якщо до 3'-кінців одного з рекомбініруемих in vitro фрагментів ДНК за допомогою кінцевий дезоксинуклеотидилтрансферазой добудувати одноцепочечниє олиго (dA) -сегмент певної довжини, а до кінців іншого фрагмента - оліго (dT) -сегмент приблизно такої ж довжини, то при змішуванні отриманих таким чином фрагментів відбувається спарювання за рахунок утворення водневих зв'язків між олиго (d А) - і олігo (dT) послідовний (рис. 40). Для ковалентного з'єднання двох фрагментів використовується ДНК-лігаза. Ці процедури складають основу для другого загального методу отримання рекомбінантних молекул ДНК.

Оскільки можна формувати досить довгі взаімокомплементарние одноцепочечниє кінці, гібридні молекули утворюються з високою ефективністю. Зокрема, тому при клонуванні ДНК-копій матричних РНК, які доступні в обмежених кількостях, зазвичай іс¬пользуют коннекторние метод. При такому способі з'єднання між фрагментами вбудовуються ділянки ААААА. Такі додаткові послідовності ТТТТТ можуть впливати на функції з'єднуються молекул і тому завжди, коли тільки можливо, для отримання рекомбінантних молекул ДНК користуються липкими кінцями, що утворилися в результаті дії рестриктаз.

Зшивання фрагментів з різнойменними липкими кінцями

У ситуації, коли необхідно зшити фрагменти, утворені різними ендонуклеаза рестрикції, і мають різні, тобто некомплементарни один одному липкі кінці, застосовують так звані лінкери (або "перехідники"). Лінкери - це хімічно синтезовані олігонуклеотиди, що представляють собою сайти рестрикції або їх комбінацію. Вперше цю ідею запропонував Шеллер з співробітниками в 1977 році.

Існують великі набори таких генних "перехідників". Природно, що при використанні лінкерів повинна враховуватися необхідність дотримання правил експресії генетичної інформації. Часто в середину линкера поміщають будь-якої регуляторний генетичний елемент, наприклад, промотор або ділянку, пов'язаний з рибосомою. В цьому випадку лінкери забезпечують не тільки об'єднання генів, але і обумовлюють їх експресію. Існують лінкери "тупий кінець - липкий кінець".

При необхідності липкі кінці можна перетворити в тупі. Це досягається або отщеплением липких кінців за допомогою ферменту - ендонуклеази S1, яка руйнує тільки одноцепочечную ДНК, або липкі кінці »забудовують", тобто за допомогою ДНК-полімерази I на однониткових липких кінцях синтезують другу нитку.

Читати далі: Визначення нуклеотидної послідовності (секвенування) ДНК

Інформація про роботу «Рекомбінантні (химерні) ДНК»

Сукупність зчеплених генів однієї хромосоми, контролюючих аллогруппу, називають гаплотипом. Значення: 1) вивчення причин і динаміки генотипической мінливості, що становить основу еволюційної генетики; 2) уточнення походження окремих тварин; 3) визначення моно- та дизиготних двійнят; 4) побудова генетичних карт хромосом; 5) використання біохімічних систем в якості генетичних.

векторів для експресії. 2.2 Способи прямого введення гена в клітку Пряме введення гена в клітку здійснюють кількома способами: 1. Трансфекція 2. Мікроін'єкція 3. Електропорація 4. Метод «міні-клітин» 5. Упаковка в ліпосоми 6. Електронна гармата При трансфекції ДНК адсорбується на кристалах фосфату кальцію (Грехем Ван дер Еб.