Прокальцитонін-маркер діагностики важкої інфекції - лабораторні технології
Ось уже кілька десятиліть сепсис і важкі інфекції залишаються однією з актуальних проблем сучасної медицини в силу неухильної тенденції до зростання числа хворих і стабільно високої летальності, незважаючи на використання нових принципів і методів лікування.
Це часто відбувається через відстроченої постановки діагнозу і початку лікування, а також через відсутність можливості точно оцінити ефективність лікування. Тому проблема своєчасної діагностики сепсису і ефективного контролю перебігу захворювання варто в даний час досить гостро.
У клінічній практиці існують дві основні проблеми при діагностуванні важкої інфекції:
- Перша - це диференціювання між інфекцією per se, тобто локальної, і генералізованої інфекцією супроводжується відповідними системними реакціями. Патофізіологічні ефекти синдрому системної запальної відповіді (ССЗВ) можуть бути визначені клінічно за наявністю ознак, але тяжкість синдрому і прогноз клінічно оцінити набагато важче.
- Друга проблема при діагностуванні сепсису - це диференціювання між інфекційної і іншими причинами синдрому системної запальної відповіді, такими як травма і Імунокомплексні захворювання. Діагностика утруднена також тим, що у великої частини пацієнтів з явною клінічною картиною сепсису, гемокультура часто буває негативною.
Запалення, що виникає після будь-якої форми тканинного ушкодження, супроводжується продукцією цитокінів і білків гострої фази, визначення яких може говорити про наявність запалення і ступеня його тяжкості. У деяких випадках визначення білків гострої фази або цитокінів може свідчити про природу запального процесу або його ускладненнях, хоча запальні процеси в цілому дуже схожі, незалежно від причини. У зв'язку з цим зрозумілий інтерес дослідників і клініцистів до прогормонов кальцитоніну і, перш за все до ПРОКАЛЬЦИТОНІН (РСТ), який, як вважають деякі дослідники, є специфічним маркером інфекції.
КЛІНІЧНА ЦІННІСТЬ ПРОКАЛЬЦИТОНІНУ
• Як діагностики сепсису, септичного шоку і важких бактеріальних інфекцій. Для диференціального діагнозу інфекційної і неінфекційної етіології лихоманки неясного генезу.
• Для моніторингу стану хворих з сепсисом, шоком; оцінки ефективності проведеного лікування; оцінки прогнозу для даного хворого.
• PCT підходить для ранньої діагностики інфекційних ускладнень:
1. Хірургічних пацієнтів
2. Пацієнтів інтенсивної терапії
3. Реципієнтів після пересадки
4. Пацієнтів на штучній вентиляції
5. Пацієнти з іммуносуперссіей
6. Пацієнти з нейтропенією
7. Пацієнти із захворюваннями неясного генезу
• PCT можна і використовувати для диференціального діагнозу:
1. Інфекційної і неінфекційної етіології (наприклад. ОРДСВ, гострого панкреатиту)
2. Бактеріальних і вірусних інфекційних захворювань (наприклад гострого менінгіту, сепсису новонароджених)
3. Гострих бактеріальних інфекцій та хронічних запальних процесів наприклад аутоімунних захворювань
4. Реакцій проти трансплантанта та інфекційних ускладнень бактеріальної і грибкової природи
• Рівні РСТ підвищуються також при важкої пневмонії, перитоніті, бактеріальному менінгіті.
• Крім того, рівні РСТ можуть підвищуватися при малярії, меліодозе, системних грибкових інфекціях.
ФУНКЦІЇ ПРОКАЛЬЦИТОНІНУ У нормі І ПРИ ПАТОЛОГІЇ
У нормальної фізіології, єдина роль, встановлена для PCT - це роль попередника кальцитонина. Кальцитонін, як відомо, регулює метаболізм кісток і кальцію, а також пригнічує резорбцію кістки остеокластами. Раніше припускали, що кальцитонін (CT), названий так за гипокаліємічеський ефект, має виключно тиреоїдних походження і грає важливу роль в структурному гомеостазі. Однак було виявлено, що при тиреоїдектомії у людей не відбувається ніяких значних патологічних наслідків щодо гомеостазу кальцію, і щільність кісток в більшості випадків залишається незмінною. Таким чином, фізіологічні функції зрілого CT у людини поки ще залишаються невідомими, які не були також досі визначені порушення, які виникають в організмі при надлишку або дефіциті зрілого кальцитонина.
ДОСТУПНІ МЕТОДИ ВИМІРЮВАННЯ
Bohuon з співавт. які вперше виявили здатність РСТ підвищуватися в організмі при мікробної інфекції розробили досить чутливий і специфічний тест для визначення рівня кальцитоніну в сироватці, використовуючи моноклональні антитіла.
Паралельно з цим, вони розробили також бібліотеку моноклональних антитіл. які визначали не тільки кальцитонін, але також РСТ, а також N- або С- термінал молекул попередників кальцитонина, кальцітоніновим гліцину, катакальціна.
Основною проблемою в той час було отримання чистого РСТ, що необхідно для стандартизації вимірювань. Ghillani і ін. Також розробили специфічний тест з моноклональними антитілами проти залишку РСТ 96 - 106 в якості основного антитіла і проти залишку 70 - 76 в якості мітки, яка виявляла тільки інтактний РСТ. Ділянка 70 - 76 є частиною молекули кальцитонина, в той час як 96 - 106 - це ділянка молекули катакальціна.
На сьогоднішній день комерційно доступними є тільки тести фірми Brahms Diagnostica, Berlin, Germany до яких відносяться Напівкількісний тест Brahms PCT-Q, іммунолюмінометріческіе тести Brahms Lumitest-PCT, Brahms LIAISON-PCT і Brahms CRYPTOR-PCT.
Brachms PCT-Q - це імунохроматографічним тест для напівкількісного визначення PCT (прокальцитоніну), який використовується для діагностики і контролю проведеної терапії гострих бактеріальних інфекцій та сепсису. Brachms PCT-Q - це тестова система з періодом інкубації 30 хвилин, яка не потребує калібрування і в додатковій апаратурі. Тест заснований на використанні моноклональних мишачих анти-катакльцінових антитіл, кон'югованих з колоїдним золотом (мітка) і поліклональних антікальцітонінових антитіл (щільна фаза).
LUMItest ® PCT - іммунолюмінометріческій тест, який може бути використаний для кількісного визначення концентрації PCT в людській сироватці і плазмі. Два антиген-специфічних моноклональних антитіла, які зв'язують PCT (антиген) на двох різних ділянках (катакальціновий і кальцітоніновий сегменти) використовуються в цьому тесті в надмірних кількостях. Один з цих антитіл - люмінесцентна маркований (мітка), а інший фіксований до внутрішньої поверхні пробірки. Протягом інкубації, обидва антитіла реагують з молекулами PCT в досліджуваній пробі, і формують "сендвічнимі комплекс". В результаті люмінесцентно-марковані антитіла, зв'язуються зі внутрішньою поверхнею пробірки. Як тільки реакція закінчується, надлишок маркованих антитіл повністю видаляється з пробірки. Після цього, залишкова кількість мітки на тестовій поверхні пробірки визначається кількісно за допомогою вимірювання сигналу люмінесценції, використовуючи для цього люмінометр і LUMItest ® Basiskit реактиви. Інтенсивність сигналу люмінесценції (RLU) прямо пропорційна концентрації РСТ в зразку.
LIAISON ® BRAHMS PCT ® - іммунолюмінометріческій двухучастковий тест (принцип сендвіча). Два різних високо специфічних моноклональних антитіла використовуються для покриття твердої фази (магнітні частинки) і для мітки. Протягом першої інкубації, PCT присутній в досліджуваній пробі і калібратори зв'язуються з маркованими антитілами. Протягом другої стадії інкубації, антитіла твердої фази реагують з уже пов'язаним РСТ. Надлишок мітки видаляється циклом вимивання. Після цього додаються реактиви стартера додані. Концентрація РСТ в зразку і калібратори вимірюється шляхом індукованої реакції хемілюмінісценції. Слабкий сигнал вимірюється та інтенсивність його прямо пропорційна концентрації прокальцитоніну в зразку. KRYPTOR ® використовує технологію TRACE, засновану на Нерадіоактивні передачі енергії. Ця передача має місце між двома флуоресцентними мітками: еуропіум кріптат (донор) і XL665 (акцептор). Сигнал, який вимірюється під час формування комплексу антиген-антитіло піддається посиленню. Тест KRYPTOR ® гомогенен, без процедур поділу або відмивання. Таким чином можливо отримати дані без прерваним імунологічної реакції. Висока концентрація РСТ в досліджувані зразки виявляється протягом перших кількох секунд інкубації. Такі проби можуть розлучатися відповідним розчином, після цього автоматично ре-аналізуватися.