Методика приготування гістологічних препаратів (Мікротехніка) - студопедія

Основними методами вивчення біологічних мікрооб'єктів є світлова та електронна мікроскопія, які широко використовуються в експериментальній і клінічній практиці. Основними об'єктами дослідження є гістологічні препарати, приготовлені з органів лабораторних тварин (щурів, собак, кроликів і т.д.), рідше з об'єктів, взятих під час оперативного втручання або від трупів людей.

Виготовлення гістологічних препаратів складається з наступних основних етапів:

1. Взяття і фіксація біологічних об'єктів;

2. Промивання, зневоднення і заливка біологічних об'єктів;

3. Приготування зрізів;

4. Фарбування і висновок зрізів.

1 - взяття і фіксація біологічних об'єктів. Головна вимога: максимальне скорочення термінів взяття матеріалу, мінімальне травмування тканин і створення оптимальних умов для фіксації. Для умертвіння лабораторних тварин застосовується наркоз, декапитация, електричний струм і т.д. Потім слід швидке розтин тварини, витяг необхідних органів і тканин, з яких гострим інструментом вирізують невеликі шматочки (5-10 мм 3) і поміщають їх в фіксатор. Обсяг фіксатора повинен перевищувати обсяг фіксованої об'єкта в 20-40 разів. Фіксація попереджає розвиток посмертних змін в тканинах, припиняючи в них біохімічні процеси. В основі дії будь-якого фіксатора лежать складні фізико-хімічні процеси, в першу чергу, коагуляція (згортання) білків. У гістологічної практиці застосовують різні фіксатори: прості, що містять один компонент (формалін, спирт, ацетон) і складні, що містять два і більше компонентів (рідина Карнуа: абсолютний спирт, хлороформ, крижана оцтова кислота; рідина Ценкера: діохромат калій, сірчанокислий натрій, сулема , формалін, дистильована вода).

2 - промивання, зневоднення і заливка біологічних об'єктів. Для отримання тонких зрізів зафіксовані біологічні об'єкти необхідно підготувати відповідним чином: зробити його досить щільним, але не крихким. Після фіксації шматочки промивають під проточною водою протягом 12-24 годин для звільнення від надлишків фіксатора. Для об'єктів, фіксованих в спирті або рідини Карнуа, цей етап пропускають. Після промивання об'єкти необхідно збезводнити і ущільнити в спиртах зростаючої фортеці, для чого послідовно використовують 50, 60, 70, 90, 96 і 100 про спирт. Далі шматочки прояснюють, для чого їх поміщають спочатку в суміш абсолютного спирту (100 о) і О-ксилолу (1: 1), потім в дві-три порції чистого О-ксилолу. Після просвітлення матеріал готовий до просочуванню в парафін. Для цього об'єкти поміщають в термостат спочатку в кашку (суміш рівних частин О-ксилолу та парафіну) при температурі 37 ° С, а потім в дві-три порції чистого парафіну, розплавленого при температурі 56 о С. Просочені парафіном шматочки наклеюють на дерев'яні блоки. Підготовлені таким чином біологічні об'єкти можуть тривалий час зберігатися на відкритому повітрі.

Для обробки твердих тканин (кістки, зуби) відразу ж після фіксації і промивання матеріалу використовують методику декальцінаціі за допомогою 5-7% розчину азотної кислоти. У міру вимивання солей кальцію під дією кислоти, тверді тканини стають м'якими, при цьому їх гістологічна структура зберігається за рахунок решти органічних речовин. Після декальцінаціі необхідно повторно промити шматочки під проточною водою, потім збезводнити, просветлить і залити в парафін.

3 - приготування гістологічних зрізів. Для приготування зрізів використовують спеціальні прилади - мікротоми. Їх три типи: санний, ротаційний і заморожують. Санний мікротом дозволяє отримувати ступінчасті зрізи, ротаційний - серійні, заморожують дає можливість отримувати зрізи фіксованого та нефіксованого біологічного матеріалу без попередньої заливки в парафін. Все мікротоми забезпечені механізмом подачі мікрооб'єкту і спеціальним мікротомних ножем.

Отримані парафінові зрізи наклеюють на предметне скло, змащене сумішшю білка з гліцерином (1: 1) і підсушують на повітрі, або в термостаті при 37 о С. Зрізи, приготовані на заморожувати мікротому поміщають в чашку з дистильованою водою, після чого відразу ж фарбують.

4 - фарбування і укладання зрізів. Фарбування зрізів застосовується для того, щоб чітко бачити під мікроскопом будову органу, і засноване на неоднаковому хімічному складі тканинних структур. Для фарбування застосовується велика кількість барвників. Всі їх можна розділити за походженням: рослинні (гематоксилін), тварини (кармін), синтетичні (еозин і ін.); а також за хімічними властивостями: кислі, основні, нейтральні.

Здатність структур забарвлюватися основними барвниками називається базофілія. У клітці базофильной структурою є ядро, що містить нуклеїнові кислоти. До базофільним барвників відносяться гематоксилин, кармін, метіонін. Структури, які фарбуються кислими барвниками, називаються Оксифільні, наприклад, цитоплазма клітин. Кислими барвниками є похідні кислот або їх солі (еозин, кислий фуксин). Нейтральні барвники (трипановим синь, нейтральний червоний).

Існують, крім того, специфічні барвники. Наприклад, еластичні волокна забарвлюються орсеїном в червоно-коричневий колір, резорцин-фуксином - в темно-синій, альдегід-фуксином - в темно-пурпуровий. Жири та жиророзчинні речовини в клітинах фарбуються Суданом III в оранжевий колір, осмій ж забарвлює жири в чорний колір. Для виявлення елементів нервової системи застосовується метод імпрегнації азотнокислим сріблом.

Перед будь-яким фарбуванням зі зрізів видаляють парафін, цей процес називається депарафінізації. Для цього зрізи послідовно проводять через три порції О-ксилолу, спирти низхідній фортеці (від 100 о до 70 о), потім поміщають у дистильовану воду. Заморожені зрізи не вимагають депарафінізації.

Підготовлені таким чином зрізи можуть бути пофарбовані практично будь-яким барвником. Найбільш часто застосовується забарвлення гематоксиліном і еозином. Для чого зрізи поміщають в розчин гематоксиліном на 3-5 хв, потім в водопровідну воду - для промивання і диференціювання. Після придбання ядрами клітин фіолетового кольору (контролюється під мікроскопом), виробляють фарбування в розчині еозину протягом 0,5-1,5 хв, промивають в дистильованої воді і зневоднюють в спиртах висхідної фортеці (від 70 о до 100 о). Далі, для видалення спирту і просвітління зрізів поміщають послідовно в три порції О-ксилолу та укладають в канадський бальзам.

У деяких випадках препарат за умовами обробки не може стикатися з спиртами, О-ксилолом (наприклад, при фарбуванні на жир), що викликає необхідність укладати в середовища, що змішуються з водою: гліцерин, гліцерин-желатину і ін.