Методи виділення, культивування та ідентифікації вірусів - студопедія
Лабораторні ісследованіяпрі проведенні ідентифікації вірусів та діагностики вірусних інфекцій включають наступні етапи: виділення, культивування, індикація (виявлення) та ідентифікація вірусів.
2.3.1 Культивування вірусів
Віруси не ростуть на штучних поживних середовищах, а розмножуються тільки внутрішньоклітинно. Великим досягненням була пропозиція Р. Гудпасчура в 1932 р використовувати для культивування вірусів курячі ембріони. Остаточне рішення проблеми культивування вірусів виявилося можливим лише після того, як були розроблені основні способи культивування клітин поза організмом.
Використання курячих ембріонів. Курячі ембріони - практично ідеальні моделі для культивування НЕ-яких вірусів (наприклад, грипу і кору). Замкнута порожнина ембріона перешкоджає проникнення новению мікроорганізмів ззовні, а також розвитку спонтанних вірусних інфекцій. Ембріони застосовують для первинного виділення вірусів з патологічного матеріалу; для пассірова-ня і збереження їх, а також для отримання необхідних кількостей вірусу. Деякі возбу-ники (наприклад, герпесвіруси) викликають характерні зміни (по ним можна розпізнавання-вать захворювання).
Для зараження зазвичай використовують курячі ембріони 7-12-денного віку. Перед зараженням визначають життєздатність ембріона шляхом овоскопирования (переглядають в світлі). Живі ембріони при овоскопирования виявляють рухову активність, добре видно судинний малюнок. Простим олівцем окреслюють межі повітряної камери.
Курячі ембріони заражають вируссодержащим матеріалом в асептичних умовах стерильними інструментами, попередньо обробивши шкаралупу над повітряним простором йодом і спиртом. Зараження проводять на хоріон-аллантоісную оболонку, в амніотичну або аллантоісную порожнину, або в жовтковий мішок (рисунок 29). Вибір методу зараження залежить від біологічних властивостей вірусу.
Малюнок 29 - Схематичне зображені ження розвивається курячого ембріона
Культура клітин. Спочатку був використаний метод переживають тканин. Він полягав у тому, що в колбу, що містить живильне середовище, вносили шматочок тканини. Клітини деяких тканин в таких умовах можуть пережив-вать (але не розмножуватися) до 30 днів, а в них можуть розмножуватися віруси. Однак цей спосіб давав дуже невеликий вихід вірусів. Необхідно було розробити умови, при яких клітини тканини могли б вільно розмножуватися.
Для отримання культур клітин необ-обхідно було вирішити чотири головні завдання:
- отримати в необхідній кількості вільні (т. Е. Ізольовані один від одного) клітини;
- створити такі поживні середовища та умови, в яких клітини могли б активно розмножуватися;
- забезпечити умови, при яких в культурах клітин не могли б розмножуватися бактерії;
- визначити методи, за допомогою яких можна було б розпізнавати зростання вірусу в культурі клітин і ідентифікувати його.
Для виділення ізольованих (роз'єднаних), але життєздатних клітин із зруйнованих тканин, стали використовувати обробку їх слабким розчином трипсину, що руйнує межкле-точні містки. Для культивування клітин були запропоновані різні середовища, що містять всі необхідні для розмноження клітин поживні речовини (амінокислоти, підстави, вітаміни та інші), мінеральні солі, які мають оптимальну рН і т. Д. До живильних середовищ додавали індикатор, зі зміни кольору якого можна було судити про метаболізм клітин і їх розмножити-ванні. Було встановлено, що в якості основи, на якій клітини розмножуються і утворюють моношар, може бути використано добре оброблене скло пробірок і колб. Для придушення можливого зростання бактерій віруссодержащего матеріал перед посівом його в культури клітин стали обраба-ють антибіотиками.
У 1949 р Дж. Ендерс, Т. Веллер і Ф. Роббінс показали, що вірус поліомієліту добре розмножується в первинно-трипсінізірована культурах клітин, отриманих з нирок мавп. Основний недолік первинно-трипсінізірована клітин полягає в тому, що після кількох пересівань вони перестають розмножуватися. Тому перевагою стали користуватися культури таких клітин, які здатні розмножуватися in vitro нескінченно довго. Такі перещеплюваних культури клітин (клітинні лінії характеризуються безсмертям і гетероплоідним кариотипом) отримують з пухлинних тканин (HeLa отримана з карциноми шийки матки, нер-2 - з карциноми гортані; Детройт-6 - з метастазу раку легкого в кістковий мозок; RН - з пухлини нирки людини) або з мутантних клітин з поліплоїдний набором хромосом. Однак пухлинні клітини не можна застосовувати для отримання вакцин. Для цих цілей використовують тільки культури таких клітин, які не містять ніяких контамінантних вірусів і не володіють злоякісністю. Найкраще цим вимогам відповідають культури диплоїдних клітин.
Полуперевіваемие (диплоїдні) культури клітин - клітини одного генотипу, здатні in vitro витримувати 50-100 пасажів, зберігаючи при цьому свій вихідний диплоїдний набір хромосом. Диплоїдні лінії фібробластів ембріона людини використовуються як для діагностики вірусних інфекцій, так і при виробництві вірусних вакцин. Як виявилося, віруси можуть розмножуватися не тільки в культурах клітин, що утворюють моношар на склі пробірок, але і в суспензіях живих клітин.
Для забезпечення життєдіяльності культивованих клітин необхідні поживні середовища. За призначенням вони поділяються на ростові і підтримують. У ростових поживних середовищах повинно міститися більше поживних речовин, що забезпечують активне розмноження клітин і формування монослоя. Підтримують середовища забезпечують переживання клітин у вже сформованому монослое в період розмноження в них вірусів.
2.3.2 Виділення вірусів
Виділення вірусів в культурах клітин. При виділенні вірусів з різних інфекційних матеріалів (кров, сеча, слизові відокремлюються, змиви з органів) застосовують культури клітин, що володіють найбільшою чутливістю до передбачуваного вірусу. Для зараження використовують культури в пробірках з добре розвиненим монослоем клітин. Перед зараженням клітин живильне середовище видаляють і в кожну пробірку вносять по 0,1-0,2 мл суспензії досліджуваного матеріалу, попередньо обробленого антибіотиками для знищення бактерій і грибів. Після 30-60 хв контакту вірусу з монослоем клітин видаляють надлишок матеріалу, в культуру вносять підтримуючу середу і проби залишають в термостаті до виявлення ознак розмноження вірусу.
Виділення вірусів на лабораторних тваринах. При неможливості виділити та ідентифікувати вірус стандартними методами in vitro інфекційний матеріал вводять чутливим до збудника тваринам, і після розвитку типового інфекційного процесу проводять повторне зараження чутливих клітинних культур. Найбільш часто використовують мишей, кроликів і мавп; для виділення деяких вірусів (наприклад, вірусів Коксакі) заражають мишенят-шмаркачів. Внаслідок дорожнечі і складності змісту лабораторних тварин, практично повсюдно їх витіснили кле-точні культури. Проте тварини моделі активно використовують для вивчення особливо-стей патогенезу і формування імунних реакцій при вірусних інфекціях.
Таким чином, для виділення чистих культур вірусів в лабораторних умовах в даний час використовуються наступні живі об'єкти (біологічні моделі): 1) культура клітин (тканин, органів); 2) курячі ембріони; 3) лабораторні тварини.
2.3.3 Індикація вірусів
Індикація вірусу в курячому ембріоні. Індикація вірусу в курячому ембріоні проводиться по загибелі ембріона, позитивної реакції гемаглютинації на склі з аллантоісной або амніотичної рідиною, за освітою фокусних поразок ( «бляшок») на хоріон-аллантоісной оболонці.
Індикація вірусів в культурах клітин. Індикатором наявності вірусу в заражених культурах клітин може служити:
1) розвиток специфічної дегенерації клітин - цитопатическое дію вірусу (ЦПД), що має три основних типи: велико- або дрібноклітинна дегенерація; утворення багатоядерних гігантських клітин (симпластов); розвиток вогнищ клітинної проліферації, що складаються з декількох шарів клітин (гроноподібна дегенерація клітин).
Розрізняють два механізми загибелі клітин, що викликається вірусами, - некроз і апоптоз. Некроз відбувається через необоротних порушень цілісності клітинних мембран, апоптоз - внаслідок фрагментації ядерної ДНК під дією клітинної ендонуклеази.
Цитопатична еффектиоценівают при мікроскопії клітинних культур. За ступенем ураження клітин виділяють віруси з високою або помірною Цитопатогенні:
2) виявлення внутрішньоклітинних включень. розташованих в цитоплазмі і / або в ядрах уражених клітин;
3) позитивна реакція гемаглютинації (РГА) або гемадсорбції (РГАдс). Деякі віруси, зокрема, вірус грипу, мають особливі рецепто-рами (гемаглютиніни), за допомогою яких вони адсорбуються на еритроцитах і викликають їх склеювання (гемаглютинацію). Такі віруси легко виявляються за допомогою реакції гемаглютинації або гемадсорбції (еритроцити адсорбуються на інфікованих вірусами клітинах куль-тури тканин);
4) феномен бляшкоутворення. Широке поширення набув запропонований в 1952 р Р. Дюльбекко метод бляшок (негативних колоній), що дозволяє проводити кількісне визначення вірусів. Для виділення вірусів моношар клітин після видалення живильного середовища заражають вируссодержащим матеріалом і покривають шаром агару, що містить індикатор нейтральний червоний. Чашки (флакони) інкубують при 37 ° С. Через 48-96 год виявляються плями - бляшки. Вони мають діаметр 1-3 мм і виглядають незабарвленими на рожевому тлі. Плями виникають за рахунок цитопатичної дії вірусу;
5) кольорова реакція Солка. Про зростання вірусів в клітинах можна судити за допомогою індикатора, який додається до живильному середовищі. Якщо клітини активно здійснюють метаболізм, рН середовища зсувається в кислу сторону, і середовище забарвлюється в жовтий колір. У разі розмноження вірусу клітки гинуть, рН середовища мало змінюється, і вона зберігає первинний (малиновий) колір або (при нейтральній рН) набуває помаранчевий;
6) реакція інтерференції (використовується при відсутності ЦПД, гемаглютинації і гемадсорбції): досліджувана культура повторно заражається вірусом, що викликає ЦПД. У позитивному випадку ЦПД буде відсутній (реакція інтерференції позитивна). Якщо в досліджуваному матеріалі вірусу не було, спостерігається ЦПД.
Крім того, для виявлення вірусу в культурах клітин можуть бути використані різні серологічні реакції.
Індикація вірусів на лабораторних тваринах. Індикація вірусу заснована на виявленні у тварин ознак інфекційного захворювання, реєстрації їх загибелі, вивченні характеру патоморфологічних і патогістологічних змін в тканинах і органах, виявленні позитивної реакції гемаглютинації.
2.3.4 Методи ідентифікації вірусів
Визначення типу вірусу (його ідентифікація) засновано на нейтралізації біологічної активно-сті вірусу за допомогою типоспецифічних сироваток. Кінцевий результат її може бути встановлений на підставі наступних ознак:
1) нейтралізація цитопатичної дії. в культуральне середовище, що містить досліджуваний вірус, вносять комерційну сироватку (наприклад, до вірусу краснухи при підозрі на неї), інкубують і заражають другу культуру; через 1-2 дня в неї вносять відомий Цитопатогенні вірус. При наявності цитопатогенного ефекту роблять висновок про те, що перша культура була заражена вірусом, що відповідав антитіл застосованої сироватки;
2) нейтралізація реакції гемадсорбції;
3) зміна прояви кольоровий проби;
4) затримка (гальмування) реакції гемаглютинації. змішують культуральну середу, со-тримає збудник, з відомою комерційної антисироватки і вносять в культуру клітин. Після інкубації визначають здатність культури до гемаглютинації і при її відсутності роблять висновок про невідповідність вірусу антисироватки.
5) нейтралізація в дослідах на тваринах.
Таким чином РН (реакція нейтралізації) заснована на придушенні відповідної реакції, феномена, розвитку інфекційного процесу після внесення в культуру або введення в організм тварини суміші вірусу зі спеці-фічнимі AT, що містяться в діагностичної сироватці.
Питання для самоконтролю
1 Назвіть основні принципи класифікації вірусів.
2 Наведіть українські та латинські назви основних сімейств вірусів людини і тварин.
3 Назвіть типових представників основних сімейств вірусів і захворювання, що викликаються ними.
4 Які особливості морфології та ультраструктури вірусів людини і тварин (основних сімейств)?
5 Назвіть РНК-геномні і ДНК-геномні фітовірусів.
6 Які етапи включають в себе лабораторні дослідження при ідентифікації вірусів та діагностики вірусних інфекцій?
7 Які біологічні моделі використовуються для виділення і культивування вірусів людини і тварин?
8 Як відбувається зараження курячих ембріонів в лабораторних умовах?
9 Які методи отримання культури клітин ви знаєте?
10 Як проводять ідентифікацію вірусів в курячому ембріоні і на лабораторних тваринах?
11 Які існують методи індикації вірусів на культурі клітин?
12 У чому полягає призначення і сутність реакцій нейтралізації вірусів?
13 Назвіть способи постановки реакцій нейтралізації вірусів.