Лекція - реакція аглютинації (ра)

Агглютинацией називається склеювання бактерій в результаті взаємодії з ними специфічних AT. Для проведення РА необхідні три компоненти: 1) АГ (агглютиноген); 2) AT (агглютинин); 3) розчин електроліту (ізотонічний розчин хлориду натрію). В реакції аглютинації беруть участь тільки корпускулярні антигени (бактерії, еритроцити, навантажені антигеном частки латексу).

Реакція аглютинації на склі. На знежирене предметне стек-ло піпеткою наносять краплю діагностичної сироватки (розведення сироватки 1:10 - 1:20). Бактеріологічною петлею беруть чисту культуру досліджуваного мікроорганізму з поверхні скошеного агару, переносять в краплю сироватки і перемішують. Результат реакції враховують неозброєним оком через 3-5 хв. При позитивній реакції в краплі сироватки відзначають появу пластівців (великих чи дрібних), добре видимих ​​на темному тлі при погойдуванні предметного скла. У разі негативні-котельної реакції рідина залишається рівномірно каламутною.

Реакція аглютинації в пробірках. В ряд пробірок вносять по 1 мл фізіологічного розчину. В першу пробірку додають рівний об'єм досліджуваної сироватки крові. Готують послідовні дворазові розведення сироватки (титрування сироватки), після чого в кожну пробірку вносять по 2 краплі суспензії інактивованих бактерій (діагностикумів). Пробірки поміщають на 2 ч в термостат при 37 ° С. Реакція протікає з утворенням дрібних пластівців, невидимих ​​неозброєним оком, тому облік результатів проводять під невеликим збільшенням в спеціальному приладі - агглютіноскопе. Інтенсивність аглютинації враховують по системі «чотири плюса»: повна аглютинація - 4+, часткова аглютинація - 3+ або 2+, сумнівний результат - +. За титр антитіл в досліджуваній сироватці приймають останнє розведення, в якому спостерігається аглютинація на 2+.

Реакцію аглютинації в пробірках (розгорнута реакція аглютинації) проводять для визначення титру антитіл до збудників черевного тифу і паратифів (реакція Відаля), бруцельозу (реакції Райта), висипного тифу (реакція Вейгля).

Аглютинація (від лат. Agglutinatio - склеювання) - склеювання (з'єднання) антігеннесущіх корпускулярних частинок (цільні клітини, частинки латексу та ін.) Молекулами специфічних антитіл в присутності електролітів, яке закінчується утворенням видимих ​​неозброєним оком пластівців або осаду (агглютіната). Характер осаду залежить від природи антигену: жгутикові бактерії дають крупнохлопьевідний осад, безжгутіковие і бескапсульних - дрібнозернистий, капсульні - тяжистость. Розрізняють агглютинацию пряму, при якій у взаємодії зі специфічними антитілами безпосередньо беруть участь власні антигени бактеріальної або будь-який інший клітини, наприклад еритроцитів; і непряму, або пасивну, при якій бактеріаль-ні клітини або еритроцити, або частки латексу є носіями не власних, а Сорбує-ванних на них чужих антигенів (або антитіл) для виявлення специфічних до них антитіл (або антигенів). В реакції аглютинації беруть участь головним чином антитіла, що відносяться до класів IgG та IgM. Вона протікає в дві фази: спочатку відбувається специфічне взаємодія активного центру антитіл з детермінантою антигену, ця стадія може відбуватися за відсутності електролітів і не супроводжується видимими змінами реагує системи. Для другої стадії - освітньої-ня агглютіната - необхідна наявність електролітів, які знижують електричний заряд комп-лексов антиген + антитіло і прискорюють процес їх склеювання. Ця фаза закінчується освіту:-му агглютіната.

Необхідно врахувати, що при змішуванні розчинів гомологічних антигенів і антитіл не завжди спостерігаються видимі прояви реакції аглютинації. Осад утворюється тільки при деяких оптимальних співвідношеннях обох компонентів реакції. Поза цими межами, при значному надлишку антигену або антитіл, реакції не спостерігається. Це явище отримало назву «феномена Прозона». Воно спостерігається як при реакції аглютинації, так і при реакції преципітації. Поява Прозона в імунних реакціях пояснюється тим, що беруть участь в них антигени, як правило, є полідетермінантнимі, а молекули антитіл IgG мають два активних центру. При надлишку антитіл поверхню кожної частинки антигену покривається молекулами антитіл так, що не залишається вільних детермінантних груп, тому другий, непов'язаний активний центр антитіл не може взаємодіяти з іншого антигенного часткою і пов'язувати їх один з одним. Освіта видимого агглютіната або преципитата пригнічується також при надлишку антигену, коли не залишається жодного вільного активного центру антитіл, і тому комплекси антиген + антитіло + антиген не можуть більше укрупнюватися.

Варіанти прискорених реакцій аглютинації. Реакція пасивної гемаглютинації і її варіанти

Класична реакція аглютинації передбачає використання корпускулярних антигенів. Однак в ній можуть брати участь і розчинні антигени. Щоб це стало можливим, такі антигени адсорбують на імунологічно інертних частинках. В якості носія можна вико-ти частинки латексу або бентоніту, проте в даний час найбільш часто застосовують еритроцит-ти тварин або людини, покращуючи їх адсорбирующие властивості обробкою розчинами таніну, формаліну або бензидина. Еритроцити, адсорбована на собі антиген, називаються сенсібілізі-рова даним антигеном, а імунна реакція, в якій вони беруть участь, - реакцією непрямої, або пасивної гемаглютинації (РНГА, або РПГА), так як еритроцити беруть участь в ній пасивно.

РПГА ставлять у спеціальних полістиролових пластинках з луночками, що мають напівсферичне дно. При використанні її для серологічної діагностики в цих луночку готують дворазові разведе-ня в фізіологічному розчині досліджуваної сироватки, і потім додають до неї в якості діагности-кума суспензія сенсибілізованих еритроцитів. Облік результатів проводять через 2 ч інкубації при 37 ° С по четирехкрестной системі. При позитивній реакції агглютініровалісь еритроцити осідають на дно ямочки і рівномірно покривають його у вигляді перевернутого парасольки. При негативній реакції еритроцити теж осідають, рідина стає прозорою, осад виглядає у вигляді маленького «диска» в центрі ямочки. Титром сироватки в РПГА вважається останнім її розведення, яке ще дає яскраво виражену гемаглютинацію без значних ознак наявності «диска».

РПГА може застосовуватися також в якості прискореного методу бактеріологічної діагностики для виявлення безпосередньо в досліджуваному матеріалі невідомих бактерій, вірусів, токси-нів, наприклад збудників чуми, стафілококових ентеротоксин і ін. При такому варіанті поста-новки РПГА в ролі відомого компонента реакції використовують еритроцити, адсорбована відомого-ні по своїй специфічності антитіла - антитільний еритроцитарний діагностикум. Якщо досліджуваний матеріал містить достатню кількість відомого антигену, РПГА буде позитивна.

Варіантами використання РПГА є: реакція нейтралізації антигену (РНАг), реакція нейтралізації антитіл (РНАт), реакція гальмування пасивної гемаглютинації (РТПГА). Для цих реакцій використовують антигенні і антитільної еритроцитарні діагностикуми. Можна використовувати одночасно дві взаємно контролюють односпрямовані реакції, наприклад РПГА з антиген-ним діагностикумів і РНАг з антитільним еритроцитарних діагностикумів.

Реакція нейтралізації антитіл (РНАт) полягає в тому, що суспензію, яка містить шуканий антиген, змішують зі специфічною імунною сироваткою, що містить відомі антитіла, в соот-відних обсягах і інкубують при 37 ° С протягом двох годин. Після цього додають антигенний еритроцитарний діагностикум. Суміш струшують і залишають при кімнатній температурі. Результати враховують через 3-4 год і остаточно - через 18-24 год. Якщо в досліджуваному матеріалі є антиген, він зв'яже антитіла (нейтралізує їх), і тому гемагглютинация не відбудеться.

За таким же принципом ставлять реакцію нейтралізації антигену (РНАг). Тільки в цьому випадку в досліджуваному матеріалі виявляють антитіла. Специфічний антиген, доданий до такого досліджуваного матеріалу, буде зв'язуватися з антитілами, що містяться в ньому, т. Е. Відбудеться нейтралізація антигену антитілами, і тому гемагглютинация при додаванні антитільної еритему-роцітарного диагностикума не відбудеться.

Реакція коагглютинации. Є одним з варіантів пасивної, т. Е. Опосередкованої кліть-ками-носіями антитіл прискореної реакції аглютинації на склі. В основу цієї реакції поло-жено унікальну властивість золотистого стафілокока, що має в складі своєї клітинної стінки білок А, зв'язуватися з Fc-фрагментами IgG і IgM. При цьому активні центри антитіл залишаються вільними і можуть взаємодіяти зі специфічними детермінантами антигенів. На предмет-ве скло наносять краплю 2% -ної суспензії стафілококів, сенсибілізованих відповідними антитілами, і додають краплю суспензії досліджуваних бактерій. За відповідності антигену антитіл через 30-60 с відбувається чітка аглютинація навантажених антитілами стафілококів.

Реакція латекс-аглютинації (ЛАГ). Носієм антитіл в цій діагностичної системі є дрібні стандартні частинки латексу. Реакцію виконують мікрометодом в лунках на склі. Основною умовою успішної постановки ЛАД є суворе дотримання кількісних співвідношень компонентів системи: до 50 мкл досліджуваного матеріалу додають 10 мкл латекс-препарату, сенсибилизированного антитілами. Специфічність ЛАД контролюють за допомогою трьох конт-рольних тестів, що містяться в комерційних тест-системах: свідомо позитивна реакція, свідомо негативна реакція і контроль якості латекс-суспензії по ЛАГ-несенсибілізованими-ним (що не несе антитіл) латексу з досліджуваним матеріалом. У нашій країні в якості носите-лей специфічних антитіл використовують полістиролові монодисперсні латекси з різними диамет-рами частинок (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 мкм). ЛАД використовують для швидкого виявлення мікроорганізмів або їх антигенів в досліджуваному матеріалі.

Іммуномагнітное виявлення антигенів. Один з варіантів прискореної реакції агглюті-нації на склі пов'язаний із застосуванням супермагнітних полімерних частинок, покритих специфічно-ми антитілами. Одна така частка пов'язує до 107- 108 клітин мікроорганізмів, завдяки чому чутливість даного методу досягає 5 КУО / мл. Іммуномагнітное виявлення микроорганиз-мов можна застосовувати в комплексі з ЦПР.

Реакція агрегат-гемаглютинації (рага). Дозволяє швидко виявити в крові хворих як вільно циркулюють антигени (антигенемія), так і антигени, пов'язані з антитілами - циркулюючі імунні комплекси (ЦВК). Для рага використовують еритроцити, сенсибілізовані-ні відповідними антитілами. Додавання сироватки крові хворого, в якій містяться антигени, до сенсибілізованим еритроцитів, на яких фіксовані антитіла, призводить до склею-ванию (аглютинації) еритроцитів і імунних комплексів.

Антиглобулінова проба Кумбса (реакція Р. Кумбса). За допомогою реакцій прямий і пасивної аглютинації визначають повні (двовалентні) антитіла. Неповні (моновалентні, що блокують) антитіла не виявляються цими методами, так як, з'єднуючись з антигеном, блокують його, але не можуть викликати агрегації антигену в великі конгломерати. Неповними (блокуючими) називають антитіла, у яких функціонує тільки один активний центр; другий активний центр з невідомої причини не спрацьовує. Для виявлення неповних антитіл використовують спеціальну реакцію Кумбса (рис. 72). У реакції беруть участь: сироватка хворого, в якій визначають неповні антитіла, корпускулярний антиген-діагностикум, антиглобулінова сироватка, яка містить антитіла до людського глобуліну. Реакція протікає в два етапи:

Взаємодія антигену з неповними антитілами. Видимих ​​проявів при цьому немає. Перший етап закінчують відмиванням антигену від залишків сироватки хворого.

Взаємодія антіглобуліновой сироватки, отриманої в результаті імунізації тваринного людським глобуліном, з неповними антитілами, адсорбованими на антигене. В силу того, що антіглобуліновой антитіла двовалентну, вони пов'язують два одновалентних антитіла окремих комплексів АГ + неповне антитіло, що призводить до їх склеювання і появи видимого осаду.

Ще роботи з біології