лекція 2
Бактеріоцини - це речовини, які мають антибактеріальну дію. Вперше були виявлені А.Грація у E. сoli в 1925 р Здатність до синтезу бактеріоцинів виявлена у різних видів як грамнегативних, так і грампозитивних бактерій.
Бактеріоцини викликають загибель бактерій того ж або близьких видів, полегшуючи конкуренцію за життєво необхідні субстрати всередині окремого або близькоспоріднених видів. Різноманітність їх велике, так само як і діапазон їх антимікробної дії: від дуже вузького до надзвичайно широкого.
На відміну від антибіотиків, секреція (синтез) бактеріоцинів супроводжується загибеллю клітини-продуцента. У популяції бактерії кількість продуцентів бактеріоцинів незначно (в середньому 1: 1000 бактерій), їх кількість при необхідності може різко збільшуватися. Бактеріоцини беруть участь у формуванні та підтримці стабільних бактеріальних спільнот (наприклад, в кишечнику людини бактеріоцини кишкової палички викликають загибель патогенних ентеробактерій - шигелл і сальмонел).
Бактеріоцини - це речовини білкової природи або представлені білком в комплексі з ліпополісахаридами, але в будь-якому випадку за антибактеріальну активність бактеріоцини відповідає білок. Бактеріоцини розрізняються по спектру дії, за фізико-хімічними, морфологічними і деяким іншим властивостям.
Згідно найбільш прийнятою класифікацією Д. Бредлі (1967), бактеріоцини ділять залежно від хімічної природи і властивостей на три групи:
1) бактеріоцини з низькою молекулярною масою; які не осідають при ультрацентріфугірованіі; чутливі до протеолитическому ферменту трипсину, під дією якого вони розщеплюються на амінокислоти; термостабільним і невиразні в електронному мікроскопі;
2) бактеріоцини з високою молекулярною масою, які легко осідають при ультрацентріфугірованіі; стійкі до ферменту трипсину; термолабільни (тобто схильні до дії температур); виявляються в електронному мікроскопі як фагоподобние структури або їх компоненти;
3) бактеріоцини, для яких чітко показано ферментативна активність.
За механізмом дії на бактеріальну клітину бактеріоцини поділяють на чотири основні групи:
1) інгібують окисне фосфорилювання в цитоплазматичної мембрані;
2) руйнують ДНК;
3) блокують синтез білків;
4) порушують напівпроникливості цитоплазматичної мембрани.
Показано, що більшість бактеріоцинів проявляють активність, не проникаючи всередину клітини. Вони передають сигнал на мішень дії за допомогою цитоплазматичної мембрани.
Встановлено, що синтез більшості бактеріоцинів детермінується особливими плазмідами, названими бактеріоціногеннимі факторами. Деякі з цих плазмід передаються при кон'югації, але більшість даних плазмід відноситься до розряду некон'югатівних.
Крім того, синтез деяких бактеріоцинів детермінується також генами, локалізованими в бактеріальної хромосомі. Це характерно для деяких грамнегативних бактерій, наприклад, Pseudomonas aeruginosa. Erwinia chrysanthemi і ін.
На біосинтез бактеріоцинів впливають умови культивування продуцента: склад живильного середовища, рН, температура, а також час інкубації продуцента.
Бактеріоціногенность (здатність до синтезу бактеріоцинів) має велике значення для розвитку популяцій бактерій. У природних умовах в результаті синтезу бактеріоцини одні клітини бактеріоціногенной популяції гинуть, в той час як більшість клітин зберігають імунітет до його дії і витісняють мікроорганізми інших видів, чутливих до нього. Таким чином формується певний мікробний ценоз. Необхідно відзначити значення мікробного ценозу в інфекційній патології. Здатність ряду бактерій синтезувати бактеріоцини або інші антимікробні речовини дає цим штамів виборче право при розвитку. Володіючи такою перевагою, патогенні бактерії, наприклад, Vibrio cholerae можуть пригнічувати нормальну мікрофлору і активно розмножуватися в кишечнику людини і тварин. Можливо, ці бактерії можуть виділяти токсичні бактеріоцини.
Практичне застосування бактеріоціногенних штамів бактерій:
1) Для отримання бактеріоцинів-консервантів, які використовуються в харчових виробництвах і для консервування. Наприклад, щорічно у всьому світі тоннами виробляють низин, що продукується лактобактеріями.
2) Використання бактеріогенних штамів як заквасок культури при різних харчових виробництвах. Синтезований бактеріоцини викликає домінування потрібної мікрофлори і придушення сторонньої мікрофлори, що забезпечує безпечне протікання мікробіологічних процесів. Наприклад, при виробництві сухої ковбаси, деяких сортів салямі як заквасок культури використовується в тому числі бактеріоціногенний штам Lactobacillus curvatus. утворює бактеріоцини курвацін. який пригнічує ріст близькоспоріднених лактобацил і умовно-патогенних бактерій і забезпечує цим безпечне протікання біохімічних процесів при дозріванні сухої ковбаси.
3) Бактеріоціногенние штами мікроорганізмів використовують у медичній практиці для лікування захворювань шлунково-кишкового тракту. Наприклад, випускаються бактеріоціногенние препарати: колибактерин (висушена суспензія живих бактерій антагоністично активного штаму E. coli М-17), біфідумбактерин (висушена суспензія живих антагоністично активних біфідобактерій), біфікол (висушена суспензія живих антагоністично активних штамів біфідобактерій і бактерій E. coli М-17 ) і ін. Такі препарати використовують в тих випадках, коли антибіотики при надмірному їх вживанні призводять до порушень вітамінного балансу, дисбактеріозу (порушення складу природної мікрофлори ішечніка) і т. п.
4) Бактеріоціногенние мікроорганізми використовуються в наукових і лабораторних дослідженнях для типування штамів бактерій.
Бактеріоцини - це абсолютно новий напрямок в мікробіології, біотехнології, сільському господарстві, харчовій промисловості та медицині. Інтенсивно цей напрямок розвивається в розвинених країнах Європи, Азії, Америки.
Як аргументи на захист користі бактеріоцинів для людини можна назвати наступні факти:
1) Бактеріоцини людина споживає з моменту свого народження - з материнським молоком і кисломолочними продуктами.
2) Виявлено бактеріоцини, які продукують мікроорганізми нашого кишечника.
3) І найголовніше. Будь-які бактеріоцини, на відміну від антибіотиків, повністю розщеплюються в організмі і ймовірність виникнення ускладнень від бактеріоцинів, мабуть, мінімальна. Застосування ж антибіотиків, як вже це все добре знають, нерідко загрожує для людини негативними наслідками.
Лекція 3. Закономірності росту чистих культур при періодичному вирощуванні. Крива зростання, характеристика окремих фаз (лаг-, логарифмічною, стаціонарної, відмирання). Первинні і вторинні метаболіти. апоптоз
* Зростання - це узгоджене збільшення кількості всіх хімічних компонентів, які формують клітинні структури.
У лабораторних і промислових умовах використовують два основних способи культивування мікроорганізмів: періодичне і безперервне.
Залежність концентрації життєздатних клітин при періодичному культивуванні від тривалості інкубування описується характерною кривою, яка має S-подібну форму (рис.). На кривій можна розрізнити кілька основних фаз росту, що змінюють один одного в певній послідовності: лаг-фазу; логарифмічну фазу; стаціонарну фазу; фазу відмирання.
Мал. 1 - Основні фази кривої зростання періодичної культури мікроорганізмів
Лаг-фаза охоплює проміжок часу між инокуляцией бактерій (внесенням певної кількості бактеріального посівного матеріалу в рідку живильне середовище) і досягненням ними максимальної швидкості ділення. У клітинах бактерій в цей період йдуть в основному процеси, пов'язані з пристосуванням їх до умов культивування. Відбувається швидке збільшення кількості РНК (в 8-12 разів).
Тривалість фази визначається наступними факторами:
1) початковими умовами культивування внесеного посівного матеріалу;
2) віком посівного матеріалу: чим старше культура, яку використовують для інокуляції нової живильного середовища, тим більший час займає лаг-фаза.
Під час лаг-фази поділу клітин не відбувається, відзначаються лише процеси, які готують клітину до розмноження. Лаг-фаза переходить в початкову фазу розмноження, коли клітини починають ділитися з поступово зростаючою швидкістю.
Фаза логарифмічного (експоненціального) зростання характеризується постійною максимальною швидкістю поділу клітин і швидкістю зростання. Для різних видів бактерій ці величини можуть варіювати в значних межах. Наприклад, бактерії E. coli при 37 о С діляться приблизно кожні 20 хв, а бактерії пологів Nitrosomonas і Nitrobacter - 5-10 ч. У підсумку культури бактерії E. coli вступають в стаціонарну фазу при концентрації клітин 2-5. '10 9 / мл.
Характеристика клітин під час логарифмічною фази:
1) всі клітини в популяції мають приблизно однаковий розмір;
2) містять максимальну кількість РНК, білка, і кількість їх постійно;
3) клітини найбільш життєздатні;
4) мають високу біохімічної активністю.
Стаціонарна фаза настає тоді, коли число життєздатних клітин досягає максимуму і не збільшується, так як швидкість розмноження бактерій дорівнює швидкості їх відмирання. У зв'язку з тим, що швидкість росту визначається концентрацією субстрату, то ще до його повного використання починає знижуватися і швидкість росту, тому перехід від логарифмічною фази до стаціонарної відбувається поступово.
Хімічний склад клітин залежить від фактора, лімітує зростання. У порівнянні з логарифмічною фазою зростання культур, клітини в стаціонарній фазі менше за розміром, містять менше РНК, більш стійкі до різного роду впливам. У цей період в клітинах або в середовищі культивування нерідко накопичуються продукти вторинного метаболізму.
Тривалість цієї фази може бути від кількох годин до кількох днів в залежності від виду мікроорганізму.
У стаціонарній фазі росту поведінку клітин в бактеріальної популяції може регулювати явище, яке отримало назву апоптоз. Суть його зводиться до того, що при вичерпанні поживного субстрату голодуюча популяція бактерій розділяється на дві субпопуляції, одна з яких гине і піддається автолизу, клітини ж іншої популяції, використовуючи продукти автолізу як субстрат, продовжують розмножуватися.
У фазі відмирання відбувається логарифмічна зниження числа живих клітин. Швидкість відмирання бактерій істотно варіює залежно від умов середовища і фізіологічних особливостей організму. Наприклад, ентеробактерії відмирають повільно на відміну від деяких видів бактерій роду Bacillus. швидкість загибелі яких відбувається швидко. Причини відмирання клітин можуть бути різними: накопичення в складі живильного середовища органічних кислот, накоантібіотіков, бактеріоцинів, автолиз (автолиз - самопереваривание клітин) і ін.
Розглянемо процес утворення метаболітів на різних етапах росту клітини.
У логарифмічною фазі утворюються продукти, життєво важливі для росту мікроорганізмів: амінокислоти, нуклеотиди, білки, нуклеїнові кислоти, вуглеводи і т.д. Їх називають первинними метаболітами. Первинні метаболіти синтезуються природними мікроорганізмами в кількостях, необхідних лише для задоволення їх потреб. Тому завдання промислових мікробіологів складається в створенні мутантних форм мікроорганізмів-сверхпродуцентов.
У фазі уповільнення зростання і в стаціонарній фазі деякі мікроорганізми синтезують речовини, що не утворюються в логарифмічною фазі і не грають явної ролі в метаболізмі. Ці речовини називають вторинними метаболітами. Їх синтезують не всі мікроорганізми, а в основному актиноміцети, гриби і спороутворюючі бактерії. Промислове отримання вторинних метаболітів становить величезний інтерес, оскільки ці метаболіти - біологічно активні речовини: наприклад, антибіотики, гормони, бактеріоцини і т.д. Вторинні метаболіти можуть істотно визначати екологію мікроорганізмів.
Наведені відомості про первинних і вторинних метаболітах вказують на важливість отримання знань про особливості окремих фаз при періодичному культивуванні. Такі знання дозволяють ефективно розвивати промислову мікробіологію.