Генна інженерія методи прямого введення гена (трансфекція, мікроін’єкція, електропорація,

Упаковка в ліпосоми

При трансфекції ДНК адсорбується на кристалах фосфату кальцію (Грехем Ван дер Еб, 1973). Утворюються частки кальцієвого преципітату. Вони поглинаються клітиною шляхом фагоцитозу.

Для підвищення ефективності трансформації до специфічної ДНК, що містить ген, за яким буде проводиться селекція, додається неспецифічна ДНК-носій. Зазвичай для цієї мети беруть ДНК з тимуса теляти або сперми лосося. Частина ДНК зв'язується з мембраною і не потрапляє в клітини. ДНК акцептують від 15 до 90% клітин. Через кілька діб після введення невелика частка клітин здатні експресувати чужорідні гени, але потім рівень експресії падає і більш-менш стабільну трансформації зазнає 10 -3 - 10 -5 клітин.

Для трансфекції використовується і ДЕАЕ-декстран, полімер, адсорбує ДНК. Ефект входження в клітини і час експресії високі, але частота стабільної трансформації нижче, ніж при використанні преципитата кальцію. Частоту трансфекції збільшує гліцериновий шок (4 хвилини в 15% розчині гліцерину в НEPES-буфері).

В клітини можна вводити будь-який ген, якщо заздалегідь лігувати його з клонованою селективним маркером. Однак подальші дослідження показали, що лігування поза клітини не обов'язково. Клітини, які поглинають селективний ген, разом з ним поглинають і іншу ДНК, наявну в кальциевом преципітатами. Таким чином, користуючись методом котрансформаціі. практично будь-який клонований сегмент ДНК можна ввести в культивовані клітини еукаріот, якщо включити цю ДНК разом з селективним маркером до складу суміші для утворення кальцієвого преципітату.

Для трансфекції можна використовувати хромосоми або фрагменти хромосом. Клітини-донори блокуються на стадії мітозу. Митотические хромосоми вивільняються під впливом осмотичного шоку і гомогенізації. Їх очищають шляхом диференціального центрифугування. Хромосоми осаджують на поверхні клітин хлористим кальцієм, а через кілька годин обробляють реагентом, здатним перфорувати мембрани (наприклад, гліцерином).

Для обробки клітин-реципієнта використовуються грубо очищені препарати хромосом, так як хромосоми при цьому руйнуються найменше. Кількість хромосом для обробки 1 клітини обмежена. Краще використовувати не більше 20 хромосом на 1 клітину-реципієнта, так як при високих концентраціях хромосом в суспензії вони агглютинируют. Рецепіентная клітина містить фрагменти донорних хромосом, які можуть вбудовуватися в геном, можуть реплицироваться самостійно. У введених фрагментах часто спостерігаються делеції.

Не всі клітини здатні до трансформації геномної ДНК з високою частотою. Людські фібробласти ефективно включають плазмидную ДНК і майже не включають геномної.

Мікроін'єкція ДНК в клітини ссавців стала можливою з появою приладу для виготовлення мікропіпеток діаметром 0.1-0.5 мікрона і мікроманіпулятора (рис. 45). Так, плазміди, що містять фрагмент вірусу герпесу з геном тимідинкінази (ТК) і плазмиду рВR322, були ін'еціровани в ТК --клітини і було показано, що ТК - ген проник в ядра і нормально в них реплицироваться. Метод введення ДНК за допомогою мікроін'єкцій був розроблений на початку 70-х років Андерсоном і Діакумакосом. В принципі, при наявності хорошого устаткування можна за 1 годину ін'єктувати 500-1000 клітин, причому в кращих експериментах в 50% клітин спостерігається стабільна інтеграція і експресія ін'єктовані генів. Перевага описуваного методу полягає також в тому, що він дозволяє вводити будь-яку ДНК в будь-клітини, і для збереження в клітинах введеного гена не потрібно ніякого селективного тиску.

Мал. 45. Введення ДНК шляхом мікроін'єкції

Електропорація заснована на тому, що імпульси високої напруги оборотно збільшують проникність біомембран. У середу для електропорації додають клітини і фрагменти ДНК, які необхідно ввести в клітини (рис. 46). Через середу пропускають високовольтні імпульси (напруга 200 - 350 В, тривалість імпульсу 54 мс), що призводять до утворення пір (електропробій) в цитоплазматичної мембрані, час існування і розмір яких достатні, щоб такі макромолекули, як ДНК, могли із зовнішнього середовища увійти в клітку в результаті дії осмотичних сил. При цьому обсяг клітини збільшується.

Напруженість електричного поля і тривалість його дії, концентрації трансформує ДНК і реципієнтних клітин для кожної системи клітин підбирають експериментально, з тим щоб досягти високого відсотка поглинання ДНК вижили клітинами. Показано, що в оптимальних умовах електропорації кількість трансформантов може досягати 80% тих, що вижили клітин.

Електропорація - фізичний, а не біохімічний метод, і це, мабуть, обумовлює його широке застосування. Численні дослідження продемонстрували, що електропорація може успішно використовуватися для введення молекул ДНК в різні типи клітин, такі як культивовані клітини тварин, найпростіші, дріжджі, бактерії і протопластів рослин. Електропорірующій ефект високовольтного розряду на біслойную липидную мембрану, мабуть, залежить від радіуса її кривизни. Тому дрібні бактеріальні клітини ефективно поглинають ДНК при значно більшій напруженості (10 кВ / см і більше), ніж великі тварини і рослинні клітини, ефективно поглинають ДНК при напруженості поля 1-2 кВ / см.

Електропорація - найбільш простий, ефективний і відтворений метод введення молекул ДНК в клітини. Однак до недавнього часу цей метод використовувався в обмеженому числі лабораторій в зв'язку з відсутністю серійних приладів - електропораторов. Поява і вдосконалення таких приладів в найближчі роки призведе до широкого застосування даного підходу в генетичній інженерії самих різних типів клітин.

Мал. 46. ​​Метод електропорації

«Міні-клітини» отримують шляхом блокування донорних клітин мітозі колцемідом. При тривалої обробці клітин колцемідом в них навколо кожної хромосоми формується нова ядерна мембрана. Обробка цитохалазином В і центрифугування призводить до утворення міні-клітин, що представляють мікроядра, інкапсульовані в цитоплазматическую мембрану.

Отримані міні-клітини дуже чутливі до різного роду впливів, тому для злиття підбирають спеціальні м'які умови. Метод важкий, примхливий, ефективність низька - 10 -6 - 10 -7.

Упаковка в ліпосоми використовується для захисту екзогенного генетичного матеріалу від руйнуючої дії рестриктаз.

Ліпосоми - сферичні оболонки, що складаються з фосфоліпідів. Отримують їх шляхом різкого струшування суміші водного розчину і ліпідів, або обробляючи ультразвуком водні емульсії фосфоліпідів. Ліпосоми, що складаються з фосфатидилсерина і холестерину найбільш придатні для введення ДНК в клітини тварин і рослин. Системи перенесення за допомогою ліпосом низькотоксичні по відношенню до клітин.

Метод біологічної балістики (біолістікі) є одним з найбільш ефективних на сьогоднішній день методів трансформації рослин, особливо однодольних.

Суть методу полягає в тому, що на найдрібніші частинки вольфраму, діаметром 0,6-1,2 мкм, напилюється ДНК вектора, що містить необхідну для трансформування генну конструкцію. Вольфрамові частинки, що несуть ДНК, наносяться на целофанову підкладку і поміщаються всередину біолістіческой гармати. Каллус або суспензія клітин наноситься в чашку Петрі з агарізірованной середовищем і поміщається під біолістіческую гармату на відстані 10-15 см. У гарматі вакуумним насосом зменшується тиск до 0,1 атм. У момент скидання тиску вольфрамові частинки з величезною швидкістю викидаються з біолістіческой гармати і, розриваючи клітинні стінки, входять в цитоплазму і ядро ​​клітин.

Зазвичай клітини, розташовані безпосередньо по центру, гинуть через величезної кількості і тиску вольфрамових часток, в той час як в зоні 0,6-1 см від центру знаходяться найбільш вдало протрансформірованние клітини. Далі клітини обережно переносять на середу для подальшого культивування та регенерації.

За допомогою біолістіческой гармати були протрансформіровани однодольні рослини, такі, як кукурудза, рис, пшениця, ячмінь. При цьому були отримані стабільні рослини-трансформанти. Крім успіхів в отриманні трансгенних однодольних, біолістіческая трансформація застосовується для прямого перенесення ДНК в ембріогенного пилок і подальшого швидкого отримання трансгенних дігаплоідних рослин, які є важливим етапом в селекційній роботі. В даний час цим методом була проведена трансформація рослин тютюну та після регенерації гаплоїдних рослин отримані стабільні трансформанти.

Інші розділи: