Залежність швидкості ферментативних реакцій від концентрації субстратів, ферментів, температури -

А). Залежність швидкості ферментативної реакції від кількості ферментів

При проведенні ферментативної реакції в умовах надлишку субстрату швидкість реакції буде залежати від концентрації ферменту. Графічна залежність такої реакції має вигляд прямої лінії .Однак кількість ферменту часто неможливо визначити в абсолютних величинах, тому на практиці користуються умовними величинами, котрі характеризують активність ферменту: одна міжнародна одиниця активності (ME) відповідає такій кількості ферменту, яке каталізує перетворення 1 мкмоль субстрату за 1 хв при оптимальних умовах проведення ферментативної реакції. Оптимальні умови індивідуальні для кожного ферменту і залежать від температури середовища, рН розчину, при відсутності активаторів і інгібіторів.

Залежність накопичення продукту (А) і убутку субстрату (Б) від часу (тривалості) протікання реакції. Швидкість ферментативної реакції визначається зміною концентрації продукту або субстрату за одиницю часу. В реакціях, що каталізуються ферментами 1 і 2, початкова швидкість реакції, що каталізується ферментом 1, нижче, ніж швидкість реакції, що каталізується ферментом 2, так як тангенс кута нахилу дотичної до кривої профілю реакції, проведеної з "О" точки у другого ферменту вище, як в разі накопичення продукту (А), так і втрат субстрату (Б). Швидкість в будь-який момент часу t визначається тангенсом кута нахилу дотичної до профілю реакції в момент часу t. Період часу ферментативної реакції [t0 -t1] характеризується лінійним накопиченням продукту (або спадом субстрату) в залежності від тривалості реакції. Період ферментативної реакції [t1 - tx] характеризується нелінійним накопиченням продукту (або спадом субстрату) в залежності від часу реакції.

Кількість одиниць активності nME визначають за формулою:

Б). Залежність швидкості ферментативної реакції від температури середовища

Підвищення температури до певних меж впливає на швидкість ферментативної

реакції подібно впливу температури на будь-яку хімічну реакцію. З підвищенням температури прискорюється рух молекул, що призводить до підвищення ймовірності взаємодії реагуючих речовин. Крім того, температура може підвищувати енергію реагують молекул, що також призводить до прискорення реакції. Однак швидкість хімічної реакції, що каталізується ферментами, має свій температурний оптимум, перевищення якого супроводжується зниженням ферментативної активності, що виникають через термічну денатурації білкової молекули

Для більшості ферментів людини оптимальна температура 37-38 ° С. Однак в природі існують і термостабільні ферменти. Наприклад, Taq-полімераза, виділена з мікроорганізмів, що живуть в гарячих джерелах, що не інактивується при підвищенні температури до 95 ° С. Цей фермент використовують в науково-практичній медицині для молекулярної діагностики захворювань з використанням методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).

В). Залежність швидкості ферментативної реакції від кількості субстрату

При збільшенні кількості субстрату початкова швидкість зростає. Коли фермент стає повністю насиченим субстратом, тобто відбувається максимально можливе при даній концентрації ферменту формування фермент-субстратного комплексу, спостерігають найбільшу швидкість утворення продукту. Подальше підвищення концентрації субстрату не призводить до збільшення утворення продукту, тобто швидкість реакції не зростає. Даний стан відповідає максимальній швидкості реакції Vmax.

Таким чином, концентрація ферменту - фактор, що лімітує в освіті продукту. Це спостереження лягло в основу ферментативної кінетики, розробленої вченими Л. Міхаелісом і М. Ментен в 1913 р

Швидкість реакції пропорційна концентрації фермент-субстратного комплексу ES, a швидкість утворення ES залежить від концентрації субстрату і концентрації вільного ферменту. На концентрацію ES впливає швидкість формування і розпаду ES.

Найбільша швидкість реакції спостерігається в тому випадку, коли всі молекули ферменту знаходяться в комплексі з субстратом, тобто в фермент-субстратном комплексі ES, тобто [Е] = [ES].

Залежність швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату виражається наступним рівнянням (математичне виведення цієї формули можна знайти в посібниках по ферментативної кінетики):

V = Vmax [S] / Km + [S]

Це рівняння отримало назву рівняння Міхаеліса-Ментен.

Рівняння Міхаеліса-Ментен - основне рівняння ферментативної кінетики, що описує залежність швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату.

Якщо концентрація субстрату значно більше Km (S >> Km), to збільшення концентрації субстрату на величину Кm практично не впливає на суму (Km + S) і її можна вважати рівною концентрації субстрату. Отже, швидкість реакції стає рівною максимальній швидкості: V = Vmax. У цих умовах реакція має нульовий порядок, тобто не залежить від концентрації субстрату. Можна зробити висновок, що Vmax - величина постійна для даної концентрації ферменту, яка не залежить від концентрації субстрату.

Якщо концентрація субстрату значно менше Km (S <

Vmах і Km - кінетичні характеристики ефективності ферменту.

Vmax дає характеристику каталітичної активності ферменту і має розмірність швидкості ферментативної реакції моль / л, тобто визначає максимальну можливість утворення продукту при даній концентрації ферменту і в умовах надлишку субстрату. Кm характеризує спорідненість даного ферменту до даного субстрату і є величиною постійною, що не залежить від концентрації ферменту. Чим менше Кm, тим більше спорідненість ферменту до даного субстрату, тим вище початкова швидкість реакції і навпаки, чим більше Кm, тим менше початкова швидкість реакції, тим менше спорідненість ферменту до субстрату.