Виділення ДНК з використанням протеїнази до

Виділення ДНК з використанням протеїнази К

Розчиняють ліофілізований протеїназу До в стерильній дистильованій воді в концентрації 20 мг / мл, розливають на аліквоти і зберігають при -20 0С.

2.Насищенний буфером фенол

У більшості випадків фенол високого ступеня чистоти можна використовувати без додаткової перегонки.

Розплавляють фенол при 65С в присутності рівного об'єму 0,5 М трис-НСІ, рН 8,0, що містить 0,2% 8-гідроксихінолін і 0,2% 2-меркаптоетанол (2-МЕ). Коли фенол повністю розплавиться, ретельно перемішують суміш, відбирають водну фазу і двічі екстрагують фенол 0,1 М трис-НСІ, рН 8,0, що містить 0,2% 2-МЕ. Після останньої екстракції водну фазу не видаляють, а залишають її в посудині з фенолом. У такому вигляді насичений фенол може зберігатися при 4 ° с до 1 міс

3. Суміш хлороформ: ізоаміловий спирт (24: 1, о / о)

4. Буфер ТЕ: 10 мМ трис-НСІ, 1 мМ ЕДТА, рН 8,0

1. Готують зразки.

2. Додають до кожного зразка по 50 мкл розчину протеїнази К (20 мг / мл) і ретельно перемішують.

3.добавляют до кожного зразка по 250 мкл розчину Саркозі, ретельно і обережно перемішують.

4. Центрифугують зразки при 3500 протягом 30 с.

5.Інкубіруют зразки при 50 0С протягом 5 ч. Для зручності інкубацію можна проводити протягом ночі (до 16 год).

6.добавляют до кожного зразка по 10 мл насиченого буфером фенолу, ретельно перемішують до утворення гомогенної емульсії.

7. Продовжують екстракцію перемішуванням при кімнатній температурі протягом 5 хв.

8. Центрифугують при 3500 протягом 1 хв.

9. Додають 10 мл суміші хлороформ: ізоаміловий спирт і продовжують екстракцію протягом 5 хв.

10. Чи поділяють водну і органічну фази центрифугуванням при 3500 протягом 6 хв при кімнатній температурі.

11. Переносять в'язку водну фазу в нову пробірку за допомогою піпетки з широким отвором і повторюють екстракцію сумішшю хлороформ: ізоаміловий спирт один або два рази (поки интерфаза не стане чистою).

12.Добавляют до водної фазі два обсягу етанолу, ретельно і обережно перемішують. Відразу після перемішування утворюється осад ДНК.

13. Cобірают осад ДНК центрифугуванням при 3500 протягом 5 хв.

14. Відбирають супернатант і промивають ДНК 20 мл 70% спирту.

15. Промивають ДНК 1 мл 70% спирту і переносять ДНК в мікроцентріфужную пробірку.

16.Осаждают ДНК центрифугуванням при 3500 протягом 1 хв і відбирають супернатант.

17. Висушують ДНК під вакуумом протягом 2,5 хв.

18. Розчиняють ДНК в ТЕ до концентрації близько 1 мг / мл