Особливості різних видів мікроскопії

Основними завданнями мікроскопії є наступні:

- виявлення мікроорганізмів в різних матеріалах;

- орієнтовна ідентифікація мікроорганізмів у зразку;

- вивчення деяких морфологічних ознак і структур мікроорганізмів (наприклад, капсул, джгутиків і т. Д.);

- вивчення пофарбованих мазків з колоній і чистих культур.

На сьогоднішній день найбільш використовуваною є світлова мікроскопія.

Світлова мікроскопія забезпечує збільшення до 2-3 тисяч разів, кольорове і рухоме зображення живого об'єкта, можливість мікрокінозйомок і тривалого спостереження одного і того ж об'єкта, оцінку його динаміки і хімізму. Зображення в світловому мікроскопі формується внаслідок того, що об'єкт і різні його структури вибірково поглинають світло з різною довжиною хвилі (абсорбційний контраст) або внаслідок зміни фази світлової хвилі при проходженні світла через об'єкт (фазовий контраст).

Основними характеристиками будь-якого мікроскопа є роздільна здатність і контраст. Роздільна здатність - це мінімальна відстань, на якому знаходяться дві точки, які демонструються мікроскопом окремо. Дозвіл людського ока в режимі найкращого бачення дорівнює 0,2 мм. Контраст зображення - це відмінність яркостей зображення і фону. Якщо ця різниця становить менше 3-4%, то його неможливо вловити ні оком, ні фотопластинкою; тоді зображення залишиться невидимим, навіть якщо мікроскоп дозволяє його деталі. Контрастом впливають як властивості об'єкта, що змінюють світловий потік у порівнянні з фоном, так і здатності оптики зреагувати на відмінності у властивостях променя. Можливості світлового мікроскопа обмежені хвильової природою світла. Фізичні властивості світла - колір (довжина хвилі), яскравість (амплітуда хвилі), фаза, щільність і напрямок поширення хвилі змінюються в залежності від властивостей об'єкта. Ці відмінності і використовуються в сучасних мікроскопах для створення контрасту.

Збільшення мікроскопа визначається як добуток збільшення об'єктива на збільшення окуляра. У типових дослідницьких мікроскопів збільшення окуляра дорівнює 10, а збільшення об'єктивів - 10, 40 і 100. Відповідно, збільшення такого мікроскопа складає від 100 до 1 000. Деякі з мікроскопів мають збільшення до 2 000. Ще більш високе збільшення не має сенсу, так як при цьому роздільна здатність не поліпшується. Навпаки, якість зображення погіршується.

Числова апертура використовується для вираження роздільної здатності оптичної системи. Числова апертура - це оптичний «охоплення» лінзи, вона є мірою кількості світла, що потрапляє в лінзу. Числова апертура об'єктива вказана на його оправі. Апаратура конденсора повинна відповідати числовий апертурі об'єктива. Числова апертура будь лінзи, що межує з повітрям (тобто «сухий системи»), не може перевищити 1, так як показник заломлення повітря дорівнює 1. Числову апертуру можна підвищити, якщо збільшити показник заломлення середовища між фронтальною лінзою об'єктива і предметним склом, наблизивши його до показника заломлення скла (1,5). Для цього між фронтальною лінзою об'єктива і досліджуваним об'єктом поміщають краплю рідини з показником заломлення більшим, ніж показник заломлення повітря, наприклад, краплю води (n = 1,3), гліцерину (n = 1,4) або кедрового (иммерсионного) масла (n = 1,5). Для кожної із зазначених вище рідин випускаються спеціальні об'єктиви, які називаються імерсійними.

Світлова мікроскопія включає звичайну просвічує мікроскопію (світло, темнопольного), фазово-контрастну, люмінесцентну. Останнім часом розроблені і інші способи мікроскопії, мікроскопи - інверсійна іконфокальная лазерна скануюча мікроскопія.

Светлопольная мікроскопія дозволяє досліджувати об'єкти в світлі в світлому полі. Даний вид мікроскопії призначений для дослідження морфології, розмірів клітин, їх взаємного розташування, структурної організації клітин та інших особливостей. У світлового мікроскопа максимальна роздільна здатність становить 0,2 мкм, що забезпечує високоточне збільшення мікроскопа до 1500х.

Фазовоконтрастна мікроскопія дозволяє більш чітко спостерігати живі прозорі об'єкти, які мають коефіцієнти заломлення, близькі до коефіцієнтів заломлення середовища. Дія фазово-контрастного мікроскопа засноване на інтерференції світла в площині зображення, зумовленої зсувом по фазі (при використанні фазового кільця в апертурними діафрагми). При фазово-контрастної мікроскопії часто застосовують біологічні мікроскопи із зворотним розташуванням оптики - інвертовані мікроскопи. У таких мікроскопів об'єктиви розташовані знизу, а конденсор - зверху.

За допомогою фазово-контрастної мікроскопії вивчають форму, розміри, взаємне розташування клітин, їх рухливість, розмноження, проростання спор мікроорганізмів і т. Д. Завдяки застосуванню цього способу мікроскопії контраст живих нефарбованих мікроорганізмів різко збільшується і вони виглядають темними на світлому фоні (позитивний фазовий контраст ) або світлими на темному тлі (негативний фазовий контраст).

Темнопольна мікроскопія заснована на висвітленні об'єкта косими променями світла. При такому освітленні промені не потрапляють в об'єктив, тому поле зору виглядає темним. Таке освітлення препарату досягається використанням спеціального темнопольного конденсора. Темнопольна мікроскопія є дуже простим, але ефективним методом і добре підходить для отримання зображення живих і нефарбованих біологічних зразків. З огляду на простоту установки, якість одержуваних зображень досить гарне.

При мікроскопірованіі в темному полі можна побачити об'єкти, величина яких вимірюється сотими частками мікрометра, що знаходиться за межами роздільної здатності звичайного светлопольного мікроскопа. Однак спостереження за об'єктами в темному полі дозволяє досліджувати тільки контури клітин і не дає можливості розглянути їх внутрішню структуру.

Люмінесцентна (флуоресцентна) мікроскопія заснована на здатності ряду речовин біологічного походження або деяких барвників світитися при їх освітленні невидимим ультрафіолетовим або синім світлом. При використанні ультрафіолетового світла роздільна здатність мікроскопа може досягати 0,1 мкм.

Клітини мікроорганізмів обробляють спеціальними барвниками - флуорохромами (акридіновий помаранчевий, прімулін, родамін і ін.) У вигляді сильно розбавлених водних розчинів: 1: 500-1: 100 000. Такі розчини слабо токсичні, що дає можливість вивчати неушкоджену клітку. Залежно від хімічного складу, клітинні структури в різному ступені адсорбируют барвники і люминесцируют різним чином. Крім того, флуорохроми неоднаково адсорбуються живими і мертвими клітинами. Це дозволяє використовувати даний вид мікроскопії для цитологічних та імунологічних досліджень, визначення життєздатності клітин і т. Д.

Електронна мікроскопія дозволяє виявити об'єкти, які не дозволяються при використанні світлових або ультрафіолетових променів. Теоретично дозвіл просвічує електронного мікроскопа складає 0,002 нм; реальний дозвіл сучасних електронних мікроскопів наближається до 0,1 нм. На практиці дозвіл для біологічних об'єктів досягає 2 нм.

Коротка довжина хвилі електронів дозволяє розрізнити об'єкти розміром 0,5-1,0 нм. У сучасних електронних мікроскопах на екрані досягається збільшення 5000- 200 000. Завдяки настільки високій роздільній здатності стає можливим виявлення деталей бактеріальних структур. Наприклад, за допомогою напилення солей важких металів, що оточують бактерію і проникаючих в поверхневі нерівності, отримують контрастування за рахунок диференціальної затримки електронів. Цей ефект отримав назву негативного контрастування.

Електронний мікроскоп, в якому зображення формується завдяки проходженню (просвічування) електронів через зразок, називають просвітчастим (або трансмісійним).

У сканирующем електронному мікроскопі (растрова електронна мікроскопія (РЕМ) пучок електронів швидко сканує поверхню зразка, викликаючи випромінювання, яке формує зображення на світному екрані. Для РЕМ характерні висока роздільна здатність, великий діапазон збільшень (до 100 000 і вище), велика глибина фокусування (

100 мкм), різноманіття режимів роботи. Скануючий мікроскоп дає картину поверхонь і дозволяє отримувати тривимірне зображення.

Лазерна конфокальна мікроскопія дає можливість отримати чітке зображення і спостерігати об'єкти в фокусі по всьому полю. Даний метод придатний лише для дослідження самосвітних (флуоресцентних) об'єктів. При поєднанні з комп'ютерної технікою можлива просторова реконструкція досліджуваного об'єкта. У конфокальному лазерному скануючому мікроскопі зображення внутрішніх перетинів формуються за рахунок сканування сфокусованим лазерним пучком від різних (405, 488, 532, 635 нм) лазерів і просторової фільтрації випромінювання. При використанні скануючої мікроскопії ближнього поля (СМБП) досягається висока роздільна здатність. Найменший розмір елемента, отриманого за допомогою СМБП, становить 20 нм при довжині хвилі світла 0,486 нм. У зображенні контрольованого елемента відсутні дифракційні або інтерференційні ефекти, що ускладнюють визначення його кордонів. Відмінною особливістю СМБП в порівнянні з атомно-силовим мікроскопом є чутливість до оптичних характеристик поверхні контрольованого зразка, довжині хвилі світла, люмінесценції і ін.

Комп'ютерна интерференционная мікроскопія дозволяє отримати висококонтрастне зображення при спостереженні субклітинних структур; у багатьох випадках застосовується для вивчення живих клітин. Принцип дії автоматизованого интерференционного мікроскопа заснований на інтерференції світлових пучків лазерного випромінювання, відбитого від опорного дзеркала і дзеркала, на якому вміщено вимірюваний фазовий об'єкт. Теоретично гранично досяжна роздільна здатність може скласти в середньому 0,2 нм, практично вона становить 0,4 мкм.

Рентгенівська комп'ютерна томографія (РКТ), позитронна емісійна томографія (ПЕТ) дозволяють спостерігати об'єкти в звичайних умовах.