Основні білки хроматину

Роль ДНК у складі як інтерфазних хромосом (хроматин інтерфазних ядра), так і мітотичних хромосом досить ясна: зберігання і реалізація генетичної інформації. Однак для виконання цих функцій у складі інтерфазних ядер необхідно мати чітку структурну основу, яка дозволила б розташувати величезні по довжині молекули ДНК в строгому порядку, щоб з певної часової послідовністю протікали процеси як синтезу РНК, так і редуплікації ДНК У інтерфазних ядрі концентрація ДНК досягає 100 мг / мл (!). В середньому на інтерфазна ядро ​​ссавців припадає близько 2 м ДНК, яка локалізується в сферичному ядрі із середнім діаметром близько 10 мкм. Це означає, що така величезна маса ДНК повинна якось бути покладена з коефіцієнтом упаковки 1 х 10 3 --1 х 10 4. І при цьому в ядрі повинен зберегтися певний порядок в розташуванні частково або повністю деконденсірованних хромосом. І крім того, повинні бути реалізовані умови для упорядкованого функціонування хромосом. Ясно, що всі ці вимоги не можуть бути здійснені в безструктурної, хаотичної системі.

У клітинному ядрі провідну роль в організації розташування ДНК, в її компактизации і в регулюванні функціональних навантажень належить ядерним білкам. Як уже зазначалося, хроматин являє собою складний комплекс ДНК з білками, дезоксірібонуклеопротеін (ДНП), де на частку білків припадає близько 60% від сухої ваги. Білки в складі хроматину дуже різноманітні, але їх можна розділити на дві групи: гістони і негістонові білки. На частку гістонів доводиться до 80% від усіх білків хроматину. Їх взаємодія з ДНК відбувається за рахунок сольових або іонних зв'язків і неспецифічно щодо складу або послідовностей нуклеотидів в молекулі ДНК. Незважаючи на переважання в загальній кількості, гістони представлені невеликою різноманітністю білків: еукаріотичні клітини містять всього 5-7 типів молекул гістонів. На відміну від гістонів, т.зв. негістонові білки здебільшого специфічно взаємодіють з певними послідовностями молекул ДНК, дуже велике розмаїття типів білків, що входять в цю групу (кілька сот), велике розмаїття функцій, які вони виконують.

Гістони пов'язані з ДНК у вигляді молекулярного комплексу, у вигляді субодиниць або нуклеосом. До цього вважалося, що ДНК рівномірно покрита цими білками, зв'язок яких з ДНК визначається властивостями гістонів.

Гістони - найбільш добре біохімічно вивчені білки (див. Табл. 5).

Таблиця 5. Загальні властивості гістонів ссавців

Ставлення основних амінокислот до кислих

Гістони - відносно невеликі за молекулярною масою білки. Ці білки практично у всіх еукаріот мають подібними властивостями, виявляються одні й ті ж класи гістонів. Класи гістонів відрізняються один від одного за змістом різних основних амінокислот. Так гістони H3 і H4 відносять до аргінін-багатим, через відносно високий вміст в них цієї амінокислоти. Ці гістони є найбільш консервативними з усіх досліджених білків: їх амінокислотні послідовності практично однакові навіть у таких віддалених видів як корова і горох (всього дві амінокислотних заміни).

Два інших гистона H2A і H2B відносяться до помірно збагаченим лізином білків. У різних об'єктів всередині цих груп гістонів виявляються міжвидові варіації в їх первинну структуру, в послідовності амінокислот.

Гістон H1, являє собою не унікальну молекулу, а клас білків, що складаються з декількох досить близькоспоріднених білків з перекриваються послідовностями амінокислот. У цих гістонів виявлені значні міжвидові і міжтканинні варіації. Однак їх загальною властивістю є обогащенность лізин, що робить їх самими основними білками, які легко відділяються від хроматину в сольових (0,5 М) розчинах. У розчинах з високою іонною силою (1-2 М NaCI) все гистони повністю відокремлюються від ДНК і переходять в розчин.

Для гістонів всіх класів (особливо для H1) характерно кластерне розподіл основних амінокислот, лізину і аргініну, на N- і C-кінцях молекул. Серединні ділянки молекул гістонів утворюють кілька (3-4) -спіральних ділянки, які Компактізующее в глобулярную структуру в ізотонічних умовах (рис. 56). Мабуть, багаті позитивними зарядами неспіралізованние кінці білкових молекул гістонів і здійснюють їх зв'язок один з одним і з ДНК.

У гистона H1 найбільш варіабельності є N-кінець, який здійснює зв'язок з іншими гистонами, а C-кінець, багатий на лізин, взаємодіє з ДНК.

У процесі життєдіяльності клітин можуть відбуватися Посттрансляційні зміни (модифікації) гістонів: ацетилювання і метилювання деяких залишків лізину, що призводить до втрати числа позитивних зарядів, і фосфорилювання серінових залишків, що приводить до появи негативного заряду. Ацетилювання і фосфорилювання гістонів може бути оборотним. Ці модифікації значно змінюють властивості гістонів, їх здатність зв'язуватися з ДНК. Так підвищений ацетилювання гістонів передує активації генів, а фосфорилювання і дефосфорілірованіе пов'язані відповідно з конденсацією і деконденсація хроматину.

Гістони синтезуються в цитоплазмі, транспортуються в ядро ​​і зв'язуються з ДНК під час її реплікації в S-періоді, тобто синтез гістонів і ДНК синхронізовані. При припиненні кліткою синтезу ДНК гістонові інформаційні РНК за кілька хвилин розпадаються і синтез гісонов зупиняється. Включилися в хроматин гистони дуже стабільні, мають низьку швидкість заміни.

Підрозділ гістонои на п'ять груп і достатню схожість їх усередині кожної групи в цілому характерно для еукаріот. Однак цілий ряд відмінностей в складі гістонів спостерігається як у вищих, так і у нижчих еукаріотичних організмів. Так у нижчих хребетних замість H1, характерного для всіх тканин цих організмів, в еритроцитах знаходять гистон H5, який містить більше аргініну і серину. З іншого боку, спостерігається відсутність деяких груп гістонів у ряду еукаріот, і в цілому ряді випадків повна заміна цих білків на інші.

Гістоноподобние білки були виявлені в складі вірусів, бактерій, мітохондрій. Так, наприклад, у E. coli в клітці у великій кількості виявляються білки (HU і H-NS), за амінокислотним складом нагадують гістони.

Функціональні властивості гістонів

Широке поширення гістонів, їх схожість навіть у дуже віддалених видів, обов'язковість входження їх до складу хромосом, все це говорить про їх надзвичайно важливу роль в процесі життєдіяльності клітин. Ще до відкриття нуклеосом існувало дві взаємодоповнюючі один одного групи гіпотез про функціональну роль гістонів, про регуляторну та структурної їх ролі.

Була очевидна і структурна, компактізірующая, роль гістонів в організації хроматину. Так поступове додавання фракції гістонів до розчинів чистої ДНК призводить до випадання в осад комплексу ДНП, і навпаки, часткове видалення гістонів з препаратів хроматину, веде до його переходу в розчинний стан. З іншого боку, в цитоплазматичних екстрактах ооцитів земноводних або яєць морських їжаків, що містять вільні гістони, додавання будь ДНК (включаючи фагів) прівводіт до утворення хроматінових фібрил (ДНП), довжина яких в кілька разів коротше вихідних ДНК. Ці дані говорять про структурну, компактізірующей ролі гістонів. Для того, щоб величезні сантиметрові молекули ДНК укласти по довжині хромосоми, яка має розмір всього кілька мікрометрів, молекула ДНК повинна бути якось скручена, компактізована з щільністю упаковки рівною 1. 10000. Виявилося, що в процесі компактизации ДНК існують кілька рівнів упаковки, перші з яких прямо визначаються взаємодією гістонів з ДНК.

Перший рівень компактизації ДНК: структурна роль нуклеосом

У ранніх біохімічних і електронномікроскопічних роботах було показано, що препарати ДНП містять нитчасті структури з діаметром від 5 до 50 нм. Поступово стало ясно, що діаметр фібрил хроматину залежить від способу виділення препарату.

На ультратонких зрізах інтерфазних ядер і мітотичних хромосом після фіксації глутаровий альдегідом виявлялися хроматірованние фібрили товщиною 30 нм. Такі ж розміри мали фібрили хроматину при фізичної фіксації ядер - при швидкому заморожуванні ядер, сколюванні об'єкта і отриманні реплік з таких препаратів. В останньому випадку виключалося вплив на хроматин змінних хімічних умов. Але всі ці методи і прийоми не давали ніякої інформації про характер локалізації ДНК і гістонів в хроматінових фібрила.

Значною подією у вивченні хроматину було відкриття двома різними способами нуклеосом - дискретних частинок хроматину. Так при осадженні на підкладку для електронної мікроскопії препаратів хроматину в лужних умовах при низькій іонній силі, можна було бачити, що нитки хроматину представляли собою щось, що нагадує "намиста на нитці": невеликі, близько 10 нм, глобули, пов'язані один з одним відрізками ДНК довжиною близько 20 нм (рис. 57, 58). Ці спостереження збігалися з результатами фракціонування хроматину після часткового нуклеазного перетравлення.

Серцевина або короваю частка (або мінімальна нуклеосома) дуже консервативні за своєю структурою: вони завжди містять 146 п.н. ДНК і октамер гістонів. Лінкерних ділянку може значно варіювати (від 8 до 114 п.н. на нуклеосому).

Використовуючи метод розсіювання нейтронів вдалося встановити форму і точні розміри нуклеосом. При грубому наближенні - це плоский циліндр або шайба діаметром 11 нм і висотою 6 нм. Розташовуючись на підкладці для електронного микроскопирования вони утворюють «намистини», глобулярні освіти близько 10 нм, гуськом, тандемно сидять на витягнутих молекулах ДНК. Насправді ж витягнутими є тільки лінкерних ділянки, інші три чверті довжини ДНК спірально укладені по периферії гістонові октамера. Сам гістонові октамер, як вважають, має форму, що нагадує м'яч для гри в регбі, до складу якого входить тетрамер (H3  H4) 2 і два незалежних димера H2A  H2B. На рис. 60 представлена ​​схема розташування гістонів в серцевинною частини нуклеосоми.

У фібрила хроматину лінкерних ділянка не лине, а продовжуючи спіраль ДНК на поверхні нуклеосомної частки, пов'язує сусідні нуклеосоми так, що утворюється як би суцільна нитка, товщиною близько 10 нм, що складається з тісно розташованих нуклеосом (рис. 61). При цьому за рахунок додаткової спирализации ДНК (1 негативний супервіток ДНК на 1 нуклеосому) відбувається первинна компактизація ДНК, з щільністю упаковки рівній 6-7 (200 п.н. довжиною 68 нм, укладені в глобулу діаметром 10 нм). Укладання майже двох витків ДНК по периферії серцевин нуклеосоми відбувається, як вважається, за рахунок взаємодії позитивно заряджених амінокислотних залишків на поверхні октамера гістонів з фосфатами ДНК. N- і C-кінцеві ділянки серцевинних гістонів, збагачені позитивними зарядами, ймовірно, служать для додаткової стабілізації структури нуклеосоми.

Провідна роль серцевинних (корови) білків в компактизации ДНК показана при самосборке нуклеосом. Регулюючи послідовність додавання гістонів і ДНК, вдалося отримати повну реконструкцію нуклеосом. У цьому процесі не має ніякого значення джерело, звідки була взята ДНК: це може бути ДНК бактерії і навіть циклічна ДНК вірусів. Виявилося, що для утворення нуклеосом гистон H1 не потрібно, він бере участь у зв'язуванні вже готових нуклеосом один з одним і в освіті більш високих рівнів компактизации ДНК. Ключовими в побудові нуклеосом виявилися гістони H3 і H4. При цьому спочатку ДНК зв'язується з тетрамером (H3  H4) 2 до якого позжепрісоедіняются два димеру H2A  H2B. Ймовірно, висока консервативність в будові гістонів H3 і H4 відображає їх провідну структурну роль на перших етапах компактизации ДНК при утворенні нуклеосом.