Методи бактеріологічного дослідження

Можливості використання бактеріологічного дослідження при очних захворюваннях обмежені межами доступності патологічного вогнища. При розташуванні його в задньому відрізку ока отримати матеріал для дослідження часто дуже важко і можливість бактеріологічної діагностики в таких випадках, природно, виключається. Основна область застосування бактеріологічної діагностики в очній практиці - це захворювання зовнішнього відділу очі, а також проникаючі поранення, при яких матеріал для дослідження може бути отриманий під час хірургічної обробки рани або при видалення стороннього тіла. Взагалі треба відмітити, що при оперативних втручаннях коло можливостей для отримання бактеріологічного матеріалу значно розширюється.

Отримання матеріалу для дослідження

Для отримання матеріалу з кон'юнктивального мішка користуються платинової петлею (при її відсутності можна використовувати петлю, виготовлену з нитки спіралі електроплитки, або інший інструмент (скляна паличка, шпатель і т. П.), Яку попередньо стерилізують прокаливанием в полум'я спиртового пальника. Відтягнувши нижню повіку , остигнула петлею захоплюють грудочку кон'юнктивального виділень з глибини нижнього склепіння. При цьому необхідно уникати дотику петлі до шкіри і країв повік, щоб не занести в матеріал стороння мікрофлора у. Брати матеріал бажано до початку лікування і в ранкові години, коли виділення буває більш рясним. При відсутності слизу і гною (наприклад, при дослідженні здорової кон'юнктиви перед операціями) слід використовувати слізну рідину або злегка поскоблить поверхню сполучної оболонки (по Лінднер). Але краще в таких випадках застосувати методику Елинніга: впустити в кон'юнктивальний мішок з пастерівської піпетки одну краплю стерильного фізіологічного розчину або бульйону і через кілька секунд відсмоктати цю краплю.

За тим же загальним правилам отримують матеріал з слізного мішка, видавлюючи його вміст, і з краю століття при виразковому блефарит, знявши попередньо корочку з виразки.

Велика обережність потрібна при взятті матеріалу з рогової оболонки, особливо при наявності повзучої виразки рогівки. Петлю (або інший тупий інструмент) слід направляти косо до поверхні виразки і брати матеріал з прогресуючого краю її. При цьому необхідна анестезія (3 краплі 1% дикаїну) і фіксація очного яблука.

Як матеріал для дослідження при проникаючих пораненнях очі можна використовувати виділення рани (якщо воно є), захопивши його петлею або марлевим тампоном, пунктат передньої камери або витягнуте чужорідне тіло, яке поміщають в стерильну пробірку з 1-2 мл фізіологічного розчину. Після струшування пробірки розчин використовують для дослідження.

З передньої камери матеріал для дослідження може бути отриманий з ріжучого інструменту під час парацентеза або за допомогою пункції. Після анестезії рогівки (3 краплі 1% розчину дикаїну) і фіксації очного яблука косо у лімба вколюють голку шприца, вводять її в передню камеру (обережно, не ранити райдужну оболонку і капсулу кришталика!) І відсмоктують 0,3 мл вмісту передньої камери.

При ендофтальміте може виникнути потреба в отриманні матеріалу з склоподібного тіла. Пункція очного яблука проводиться після анестезії (1 мл 2% розчину новокаїну під кон'юнктиву) гострої і з досить широким просвітом голкою, вколюють ближче до екватора. Відсмоктується 0,3-0,5 мл внутрішньоочного вмісту.

Отриманий матеріал піддається вивченню з метою виявлення мікроба і визначення його виду (мікробіологічний діагноз). Матеріал може вивчатися:

на предметному склі (бактериоскопический метод);
в посівах (власне бактеріологічний метод);
в експерименті на тварині (біологічний метод).

Бактеріоскопічний метод

може бути використаний в умовах будь-якого очного стаціонару при наявності нескладного лабораторного устаткування і деяких реактивів.

Для цього необхідно мати наступне:

металеву петлю;
чисті предметні скельця (на чистому склі крапля води розпливається, а не приймає кулясту форму);
ванночку з підставками для предметних стекол (скляні палички або товста мідний дріт);
дистильовану воду;
спирт;
пінцет;
фільтрувальну папір;
розчин Люголя (йоду 1 г, йодистого калію 2 г, дистильованої води 300 мл);
розчини фарб (краще в склянках, закритих пипетками з гумовими балончиками).

Для очищення нові скла кип'ятять в 1% розчині соди (можна використовувати золу), а потім промивають водою, слабкою соляною кислотою і знову водою. Скло, що були у вжитку, поміщають на 1-2 години в сірчану кислоту, після чого кип'ятять в розчині соди, промивають водою і опускають в 96 ° спирт. Зберігають скла або в спирті, або, витерши спирт, сухими, в банках з притертою пробкою.

Найбільш вживані фарби: карболовий фуксин Ціля (фуксину основного 1 г, кристалічної карболової кислоти 5 г, спирту 96 ° 10 мл, гліцерину - кілька крапель, дистильованої води 100 мл). Для забарвлення фуксин Ціля зазвичай розводять дистильованою водою в 10 разів (розведений, або водний фуксин). Метиленова синька (метиленової синьки 10 г, спирту 96 ° 100 мл). З неї готують лужну синьку Леффлера (спиртового розчину синьки 30 мл, 1% калійної або натрієвої лугу 1 мл, дистильованої води 100 мл). Карболовий генціанвіолет (готується так само, як карболовий фуксин Ціля).

Мікробів вивчають або в живому вигляді (способи «роздавленою» і «висячої» краплі), або убитими (в пофарбованому препараті). Дослідження в живому вигляді в основному виявляє здатність мікробів до активного руху, тоді як пофарбовані препарати дозволяють добре вивчити їх морфологію.

Розрізняють прості способи забарвлення, коли зазвичай вживається одна фарба, і складні способи забарвлення, що виявляють деякі особливості фізико-хімічної будови мікробної клітини і мають тому диференційно-діагностичне значення.

Техніка приготування забарвлених препаратів зводиться до наступного. Матеріал наносять на чисте предметне скло і рівномірно розподіляють по поверхні у вигляді гуртка або овалу. Мазок повинен бути досить тонким. При наявності густого гною слід попередньо нанести на предметне скло одну краплю дистильованої води і розмішати матеріал в цій краплині. Мазок висушують на повітрі. Скло з висушеним препаратом беруть за краї великим і вказівним пальцями мазком догори і фіксують триразовим проведенням через полум'я спиртового пальника (на кордоні світлої і темної його частини). При достатній фіксації відчувається легке печіння в пальцях. Зафіксований мазок забарвлюють. Готують кілька препаратів, щонайменше два, один з яких забарвлюють простим способом (метиленовая синька Лефлера, розведений фуксин Ціля), інший - за способом Грама.

Фарбування по Леффлеру:

на мазок кладуть шматочок фільтрувального паперу і наливають розчин синьки Леффлера на 3-5 хвилин;
препарат промивають дистильованою водою і висушують.

Фарбування по Граму:

на мазок кладуть шматочок фільтрувального паперу, на який наливають розчин генціанвіолета на 1-2 хвилини;
зливають фарбу, знімають папірець і, не промиваючи водою, наливають яа препарат люголевскім розчин на 1 хвилину; при цьому мазок чорніє;
зливають люголевскім розчин і знебарвлюють мазок спиртом (краще шляхом занурення препарату в стаканчик зі спиртом до припинення відходження фіолетових цівок);
ретельно промивають водою;
заливають мазок розведеним фуксином на 1-2 хвилини;
зливають фарбу, промивають препарат водою і висушують.

Зручний спосіб Грама в модифікації Синьова, який запропонував користуватися заздалегідь приготованими шматочками фільтрувального паперу, просоченої розчином генціанвіолета і висушеної. На мазок попередньо наносять 2-3 краплі води і потім кладуть ці шматочки паперу. Далі надходять, як описано вище.

Мікроскопію мазків виробляють з іммерсійним об'єктивом. При фарбуванні за Леффлеру всі мікроби забарвлюються в синій колір; при фарбуванні за Грамом - або в синьо-фіолетовий (грампозитивні мікроби), або в червоний колір (грамнегативні мікроби).

Обмежене число мікробів, які беруть участь в захворюваннях зовнішнього відділу очі, і їх характерні морфологічні ознаки нерідко дозволяють поставити правильний мікробіологічний діагноз вже за допомогою одного тільки бактеріоскопічного дослідження.

бактеріологічний метод

стає необхідним в тих випадках, коли вивчення в мазках виявляється недостатнім для встановлення виду мікроба або виникає потреба у визначенні чутливості виділеного збудника до антибактеріальних препаратів.

Надсилаючи за докладним ознайомленням з бактеріологічним методом до спеціальних інструкцій з мікробіології, зупинимося тут лише на принципах цього методу. Перший етап роботи зводиться до виділення окремих видів мікробів, т. Е. До отримання чистих культур. Для цього вдаються до механічного роз'єднання матеріалу при посіві і до використання середовищ, найбільш придатних для розвитку передбачуваних збудників (елективні середовища). Шляхом пересіву окремих колоній, що виросли на середовищі, отримують чисту культуру, яку досліджують під мікроскопом (готують мазки) та пересівають на диференційно-діагностичні середовища для вивчення біохімічних властивостей збудника.

Висока вимогливість більшості патогенних для ока мікробів в умовах культивування зумовила переважне застосування для їх виділення елективних середовищ, що містять нативний білок. Такі, наприклад, середа Ельшніга (одна частина кінської сироватки або асцитичної рідини і дві частини бульйону), згорнута сироватка Леффлера (три частини сироватки і одна частина бульйону з 1% пептона, 0,5% NaCl і 1% виноградного цукру), кров'яний агар Левенталя (агар і 5-10% дефібринованої крові).

Що стосується визначення чутливості мікробів до антибіотиків, то найбільш простий спосіб такого визначення полягає в використанні спеціально виготовлених промисловістю дисків з фільтрувального паперу, просочених розчинами антибіотиків і висушених в вакуумі. Матеріал для дослідження (гній. Пунктат, витягнуте чужорідне тіло) поміщають в стерильну пробірку з фізіологічним розчином (1,5-2 мл). Після струшування рідина виливають в чашки Петрі, краще в дві - одну з цукровим, іншу з кров'яним агаром - і погойдуванням рівномірно розподіляють по поверхні середовища. Потім на поверхню агару накладають диски з різними антибіотиками на відстані 2 см один від одного і від краю чашок. Чашки ставлять в термостат (37 °) і на наступний день по величині зони затримки росту навколо дисків судять про ступінь чутливості мікроба до випробуваним антибіотиків. Відсутність зони затримки росту вказує на нечутливість мікроба до даного антибіотика.

біологічний метод

в очній практиці застосовується тільки в тих випадках, коли при утрудненою діагностиці Токсигенні властивість може виявитися вирішальним у визначенні виду мікроба (наприклад, при диференціальної діагностики дифтерійної палички і палички ксероза).

Лабораторна діагностика вірусних захворювань ока

В даний час спеціальне вивчення вірусів, в тому числі вірусу трахоми (рис. 77), здійснюється за допомогою культивування їх в культурах тканин (курячий ембріон, асцит-карцинома мишей і ін.) І електронної мікроскопії.

Мал. 77. Клітинні включення при трахомі.

У клінічній практиці для діагностики трахоми застосовується метод цитологічного вивчення зіскрібка кон'юнктиви на наявність або відсутність тілець (включень) Провачека-Гальберштедтера. Для цього тупим скальпелем або краєм предметного скла соскабливают епітеліальний покрив кон'юнктиви (без крові), який наносять тонким шаром на предметне скло, протягом 5 хвилин підсушують на повітрі і фіксують шляхом опускання на 15-20 хвилин в стаканчик з метиловим спиртом або сумішшю Нікіфорова ( етиловий ефір і абсолютний спирт в рівній кількості). Фарбування роблять протягом 3-4 годин свіжоприготовленим розчином фарби Романовського-Гімза (з розрахунку одна крапля фарби на 1 мл дистильованої води). Потім препарат промивають плинної водою, підсушують на повітрі і досліджують під мікроскопом. При цьому ядра епітеліальних клітин виявляються забарвленими в рожевий колір, протоплазма - в світло-синій, включення - в синій, синьо-фіолетовий колір (рис. 77). Останні подаються у вигляді коккоподібних утворень, розташованих серед дрібнозернистої маси, і визнаються носіями трахоматозний вірусу. Вони частіше виявляються в свіжих випадках нелікованою трахоми, але можуть зустрічатися і при паратрахомних кон'юнктивітах.

Дослідження останніх років виявили нову форму контагиозного вірусного захворювання очей - епідемічний кератокон'юнктивіт, а цитологічне вивчення кон'юнктивального зіскрібка при цьому захворюванні дозволило виявити в епітеліальних клітинах своєрідні включення, абсолютно відмінні від тілець Прсвачека (Б. Л. Поляк, Н. В. Плошінская).