Конструювання молекул,

Ігор Хмелько
Ці ж матеріали в форматі MS Word можна забрати на сайті WETWARE.

В даному розділі описана процедура конструювання нової DNA молекули. У термінах Vector NTI, конструювання - це створення молекул з повністю визначених фрагментів, поєднання яких визначається користувачем програми.

Конструювання молекули DNA виконується за наступною схемою:

  1. Вибір і опис фрагментів молекули;
  2. Створення списку фрагментів, що описує цільову молекулу (Goal Molecule Definition List);
  3. Виклик відповідного інструменту і власне конструювання молекули.

Молекула DNA може бути зібрана з різних типів фрагментів - з фрагментів існуючих молекул, лінкерів, адаптерів і т.п. Значна частина роботи при конструюванні молекул - це визначення фрагментів, опис лінкерів і адаптерів займає значно менше часу. На щастя, в складі Vector NTI є спеціальний інструмент - Майстер фрагментів (Fragment Wizard), який "керує" користувачем в процесі опису нового фрагмента і забезпечує швидкість і прозорість процедури.

Крім конструювання, в рамках інструментарію Vector NTI для створення і додавання нової молекули в базу даних існує цілий ряд можливостей, зокрема:

  • Опис молекули може бути імпортовано з GenBank, EMBL, FASTA;
  • Для опису молекули може бути використана послідовність з будь-якого текстового файлу;
  • Молекула може бути розроблена за правилами вбудованої в Vector NTI бази біологічних знань.

Молекули, які зібрані з фрагментів, в термінах Vector NTI називаються сконструйованими молекулами. Молекули, опис яких імпортовано або складено вручну, називаються базовими молекулами, тому що вони записуються в базу даних як щось ціле на противагу сконструйованим молекулам, для яких разом із загальними даними записується інформація про вихідні фрагментах.

Отже, наше завдання - створити нову молекулу на базі клонування гена стійкості до тетрацикліну з pBR322 в pUC19, використовуючи сайти рестрикції EcoRI і AvaI в pBR322, EcoRI і SmaI в pUC19.

Відкриємо Display Window

Відкриємо Display Window для pBR322 і pUC19. Для цього запустимо програму Vector NTI, вікно Database Explorer відкриється автоматично (його також можна викликати з працюючої програми, клікнувши на відповідну піктограму). Виберемо базу даних DNA / RNA Molecules (MAIN) і в переліку молекул знайдемо pBR322 і pUC19. Молекули потрібно вибрати мишкою (одноразовий клік), утримуючи клавішу Ctrl. Далі необхідно з меню DNA / RNA вибрати команду Open. У програмі відкриється по одному Display Window для кожної молекули.

Максимізували обидва вікна (кнопка у верхньому правому куті), при цьому природно ми будемо бачити тільки одне Display Window (для pBR322), а друге буде приховано. Перемикатися між вікнами можна за допомогою команд меню Window програми Vector NTI. Зменшимо текстове поле в кожному вікні і збільшимо графічне таким чином, щоб позначення властивостей і мітки були чітко видні.

Тепер можна приступити до визначення цільової молекули.

Визначимо перший фрагмент

Перший фрагмент буде складатися майже повністю з молекули pUC19. 5 'кінець фрагмента буде відповідати сайту SmaI, а 3' - сайту рестрикції EcoRI.

Активуємо pUC19 Display Window. Зробимо графічну частину вікна активної (одноразовий клік в поле графічної частини або клік на відповідній піктограмі).

Тепер натиснемо клавішу Add Fragment to Molecule Goal List.

В результаті відкриється діалогова панель Fragment Wizard. Fragment Wizard - це послідовність діалогових панелей, що описують відповідні дії користувача, які необхідно виконати для визначення фрагмента. Якщо випадково в процесі визначення буде зроблена помилка, можна буде повернутися до попередніх дій (натисканням на клавішу Back). Зауважимо, що вікна Майстра не є модальними і ми можемо продовжувати працювати з Display w i ndow, переміщаючи панель Майстри, так, щоб він не заступала необхідні нам сайти рестрикції.

На першій панелі Майстри виберемо опцію Construction Fragment і натиснемо на кнопку Next.

Наступна панель Майстри дозволяє визначити 5 'кінець нового фрагмента. Кликнемо на мітці сайту рестрикції SmaI (в графічному вікні). Координати і назва сайту автоматично перепишуть у вікно Майстра. Знову натиснемо на кнопку Next.

Наступний крок - визначення 3 'кінця фрагмента. Утримуючи кнопку Sift, кликнемо на мітці сайту EcoRI. Інформація про сайт рестрикції також як і в попередньому випадку перепишеться у відповідні поля панелі Майстра. Це остання панель Майстри (клавіша Next заблокована), тому слід натиснути на Finish.

В результаті з'явиться вікно New Fragment, що описує основні параметри фрагмента і пропонує додати фрагмент в список.

При натисканні на клавішу Add to list фрагмент буде додано до Molecule Goal list. Якщо представлена ​​про фрагмент, некоректна, від нього можна відмовитися, натиснувши на клавішу Cancel, в цьому випадку ми повернемося до Майстра фрагментів.

Визначимо другий фрагмент

Використовуючи меню Window, перейдемо до pBR322. Зробимо активної графічну частину вікна і натиснемо на піктограму Add Fragment to Molecule Goal List. В результаті знову відкриється Fragment Wizard. Перемістимо панель Майстри так, щоб було видно сайти EcoRI і AvaI.

На першій панелі майстра виберемо опцію Construction Fragment (вона буде вже обрана за замовчуванням). Далі виберемо сайт EcoRI для 5 'кінця фрагмента.

Натиснемо на кнопку Next, і утримуючи на клавіатурі кнопку Sift, визначимо рестрикційний сайт AvaI для 3 'кінця.

При натисканні на клавішу Finish з'явиться вже знайоме нам повідомлення про новий фрагменті. Додамо цей фрагмент до списку. Тепер і другий фрагмент нашої молекули записаний в Molecule Goal list.

Перевіримо список фрагментів

Натиснемо на піктограму Molecule Goal list на основній панелі інструментів Vector NTI.

В результаті буде викликана діалогова панель Construct Molecule. Як ми бачимо, у Вас є два, визначених нами, фрагмента.

Введемо загальну інформацію про нову молекулі

В поле Name: замість NEWMOL введемо назву нової молекули, наприклад My Molecule.

Натиснемо на клавішу General Info і у вікні, введемо наступні дані:

  1. В поле Description запишемо "My molecule # 1";
  2. У групі Extra-Chromosome Replication виберемо прапор "Bacteria";
  3. У групі Replicon Type виберемо прапор "Plasmid";
  4. В поле Key Words впишемо прізвище або псевдонім і натиснемо кнопку Add (Це потрібно для того, щоб потім можна було б розшукати своє "творіння" в загальній базі даних).

Натиснемо ОК і повернемося до панелі Construct Molecule.

Звернемо увагу на перемикачі, розташовані вище секції з фрагментами молекули. Вони дозволяють вибрати варіант початку нової молекули. Перший фрагмент молекули в списку підготовлений програмою в якості фрагмента "реципієнтную" молекули. Таким чином в якості старту молекули можна вибрати або рецпіпіентний фрагмент або задати конкретні координати початку. Виберемо Recipient Start, в цьому випадку початок нової молекули співпаде з початком першого фрагмента (pUC19).

Спробуємо побудувати молекулу

Натиснемо клавішу Construct у верхньому правому куті панелі Construct Molecule. Спочатку програма попросить нас вибрати базу даних для нової молекули. У відповідне поле введемо, наприклад, "My base" і натиснемо ОК. Програма повідомить нам, що бази з таким ім'ям не існує і запропонує створити її. Відповідаємо ствердно.

У процесі конструювання молекули Vector NTI виявить, що лівий кінець фрагмента # 1 (сайт SmaI) непорівнянний з правим кінцем фрагмента # 2 (сайт AvaI). В результаті ми отримаємо повідомлення від Vector NTI, про те, що він не в змозі завершити процес.

Це сталося через те, що "тупий" кінець фрагмента pUC19 (5 ') не може бути пов'язаний з "липким" кінцем фрагмента pBR322 (3'). Необхідно модифікувати ці кінці, так, щоб в результаті вони підійшли один одному.

Нам необхідно модифікувати AvaI сайт, який формує правий кінець нашого фрагмента. Натиснемо клавішу Right Terminus - відкриється панель Right Term inus (Terminus Editor).

Vector NTI "вміє" виконувати до трьох послідовних біохімічних операцій над кінцем фрагмента, однак на цей раз, нам необхідна всього одна операція - добудова липкого кінця сайту AvaI. Виберемо в верхньому списку секції Completely filled in.

Тепер натиснемо послідовно клавішу ОК в Terminus Editor і під Fragment Editor. Ми знову потрапимо на панель Construct Molecule. Натиснемо на клавішу Construct і відповімо ствердно з приводу використання бази My base і з приводу того, що інформацію про нашу молекулі в базі слід переписати (Overwrite). Vector NTI проаналізує нашу молекулу і в цей раз запише її в базу даних без будь-яких проблем.

Подивимося, що вийшло

Після створення нової молекули і запису інформації про неї в базу даних Vector NTI відкриває для неї Display Window. Знайдемо на зображенні молекули TC (R) і зауважимо, що ми не вводили функціональність і карту рестрикції в ручну, все це програма сформувала автоматично.

Звернемо увагу на текстову панель Display Windows. В описі молекули з'явилася папка "Component Fragments". У цій папці ми побачимо два наших фрагмента.

Ми зібрали молекулу, визначивши всі необхідні сайти рестрикції і біохімічні операції для клонування фрагмента з pBR322 в pUC19. Подібна робота на основі призначених для користувача параметрів, в термінах Vector NTI називається конструюванням. Ту ж операцію з клонування, супроводжувану переміщенням TC (R) з pBR322 в pUC19, можна виконати без вказівки сайтів і біохімічних операцій. Все це можна доручити Vector NTI, подібна робота в термінах програми називається дизайном молекули, однак опис цієї процедури виходить за рамки даного розділу.

Ці ж матеріали в форматі MS Word можна забрати на сайті WETWARE