Класифікація індукторів інтерферону, придатних для клінічного використання

В даний час є всі підстави вважати, що в недалекому майбутньому область клінічного застосування індукторів інтерферонів буде значно розширена, і ці препарати зможуть, подібно интерферонам, використовуватися при ГРВІ, герпесі, вірусних гепатитах, ВІЛ-інфекції, енцефалітах, сказі, а також для попередження вторинних вірусних ускладнень, що виникають в результаті застосування цитостатиків і імунодепресантів.

Індуктори інтерферону відносяться до нового покоління ліків. Застосування цих препаратів має ряд переваг перед рекомбінантними інтерферонами:

Індуктори інтерферонів не володіють антигенностью.

Природний (але стимульований) синтез ендогенного інтерферону не викликає гіперінтерферонеміі, яка нерідко виникає при використанні рекомбінантних інтерферонів і призводить до тяжких побічних явищ.

Одноразове введення індукторів інтерферону забезпечує тривалу циркуляцію інтерферону на терапевтичному рівні. Для досягнення такого рівня екзогенних інтерферонів потрібне багаторазове введення високих доз рекомбінантних інтерферонів. Деякі індуктори інтерферону мають унікальну здатність запускати синтез інтерферону в певних популяціях клітин, що має суттєві переваги перед поликлональной стимуляцією імуноцитів рекомбінантними інтерферонами.

Індуктори інтерферону мають імуномодулюючі властивості і поєднуються не тільки з рекомбінантними інтерферонами, але і з іншими противірусними препаратами, викликаючи при цьому синергічний ефект при одночасному застосуванні.

Широко застосовуються рекомбінантні інтерферони є препаратами α-інтерферону, що значно обмежує їх противірусні властивості, тому що для ефективної противірусної захисту потрібна наявність усіх трьох класів інтерферонів, синтез яких і викликається застосуванням індукторів інтерфероногенезу.

Гормон росту (соматотропний гормон) - білок, що секретується передньою долею гіпофіза хребетних тварин. Наявність його в екстрактах з гіпофіза було відзначено в 1921 рр. Евансом і Дж. Лонгом, але лише через два десятиліття в 1944 році він був отриманий у вигляді очищеного препарату, а в 1948 р - в кристалічному вигляді.

У гіпофізі людини міститься від 3,7 до 6 мкг гормону росту, він представлений однією поліпептидного ланцюжком з 191 амінокислотного залишку

Гормон росту людини, синтезований в спеціально сконструйованих клітинах бактерій, має очевидні переваги: ​​доступний у великих кількостях, його препарати є біохімічно чистими і вільними від вірусних забруднень. Біосинтез соматотропіну було здійснено Гедделем з співробітниками Оскільки при синтезі ДНК на мРНК гормону з подальшим перетворенням її в двухнітіевую форму виходить ген, що кодує попередник соматотропіну, який розщеплюється в бактеріальних клітинах з утворенням активного гормону, дослідники обрали наступний підхід. На першому етапі клонували двухнітіевую ДНК-копію мРНК і розщепленням рестрикційний ендонуклеаза отримали послідовність, що кодує всю амінокислотну послідовність гормону, за винятком перших 23 амінокислот. Потім клонували синтетичний полинуклеотид, відповідний амінокислотам від 1-ї до 23-ї та, нарешті, два отриманих фрагмента об'єднали разом, і «підлаштували» до пари промоторів і ділянці зв'язування рибосом. Кінцевий вихід гормону склав 2,4 мкг на 1 мл культури або 1% від розчинених білкових клітин цього генетично сконструйованого штаму E.coli.

Інсулін (від ГИСТ. Insulae pancreaticae - панкреатичні острівці) - белковопептідний гормон, який синтезується в β-клітинах острівців підшлункової залози; є універсальним анаболічним гормоном, необхідним для росту і розвитку організму, подібно соматотропного гормону гіпофіза, синергистом якого в цьому відношенні він є. Одним з найбільш яскравих ефектів інсуліну служить його гіпоглікемічну дію.

Інсулін - один з найбільш повно вивчених гормонів підшлункової залози. Дія цього гормону пов'язане з регулюванням вмісту цукру в крові. Вважають, що інсулін здійснює допоміжну функцію при перенесенні глюкози з крові через стінки судин до м'язової тканини, де глюкоза витрачається для енергетичних цілей, або до клітин печінки, де з глюкози синтезується резервний полісахарид - глікоген. Припускають, що інсулін сприяє видаленню глюкози з крові в результаті його специфічної орієнтації на поверхні клітинної оболонки, що полегшує проникнення через неї глюкози з крові. При нестачі інсуліну концентрація глюкози в крові починає підвищуватися, тому що глюкоза не може вільно дифундувати всередину клітин. Останнім часом вважають, що інсуліну належить важлива роль в регуляції біосинтезу глюкози в організмі.

Структура інсуліну була встановлена ​​Сенджер. Це циклічний гетерогенний пептид, що складається з двох ланцюгів, з'єднаних двома сульфідними містками. В одній з ланцюгів, крім того, є внутрішній дисульфідних місток. У ланцюзі А міститься 21, а в ланцюзі У - 30 амінокислотних залишків.

З часу проведення перших дослідів по використанню інсуліну для лікування діабету в 1922 році цей гормон виділяли з підшлункової залози тварин (корів і свиней).

Існує кілька причин, за якими доцільна розробка методів великомасштабного виробництва і випуск на ринок інсуліну людини: серед них комерційні міркування і емоційні чинники, і потреби розвитку науки, і можливі переваги при лікуванні.

Інсулін, як корів, так і свиней трохи відрізняється по амінокислотної послідовності від інсуліну людини. Особливо близькі інсуліни людини і свині: у останнього лише С-кінцевий треонин В-ланцюга замінений на аланін. Інсуліни корови і людини різняться трьома амінокислотним залишкам, і саме цими відмінностями визначається підвищена імуногенна активність інсуліну корови в порівнянні з інсуліном свині. Майже у всіх хворих, яких лікують звичайним методом, тобто вводять їм інсулін корови, в крові з'являються антитіла до інсуліну. Антигенні властивості інсуліну частково визначаються домішками в його препаратах. Швидше за все, саме освітою антитіл до інсуліну пояснюються деякі незначні побічні ефекти при ін'єкціях інсуліну корови, наприклад, атрофія підшкірного жирового прошарку. У разі високоочищеного інсуліну свині ці ефекти відсутні. Далі антитіла до інсуліну інактивують його в кровотоці, так що хворому доводиться вводити великі дози, ніж це необхідно. Антитіла впливають і на тривалість біологічної дії введеного інсуліну. Можна припустити, що інсулін людини буде ще менш імуногенні, ніж інсулін свині.

Так як число хворих на діабет і відповідно потреба в інсуліні ростуть, то цілком можливо, що доступність його в майбутньому зменшиться через брак вихідної сировини - підшлункової залози тварин. Через чисто емоційних чинників краще використовувати інсулін людини, ніж будь-якого тваринного.

Ряд виробників інсуліну на чолі з фірмою «Eli Lilly and Co» використовували як основу для виробництва інсуліну людини технологію рекомбінантних ДНК. Згідно зі схемою процесу, розробленого «Eli Lilly» у співпраці з фірмою «Genenetech Inc.», на першому етапі відтворюють послідовність ДНК по амінокислотної послідовності інсуліну, окремо синтезуючи штучні гени його А- і В-ланцюгів. На 5-кінці кожного з них розташовується кодон метіоніну (який в синтезованому білку виявляється N-кінцевим), а на 3-кінці - терминирующего послідовності. Кожен з генів вбудовується потім в ген β-галактозидази плазмід, а їх в свою чергу вводять в клітини E.coli. Оскільки бактерії ростять на середовищі з галактозою, то в них індукується синтез β-галактозидази, а разом з нею А- і В-ланцюгів інсуліну, приєднаних через залишок метіоніну. Після лізису бактерій і обробки бромцианом, який специфічно розщеплює білки по залишку метіоніну, ланцюги інсуліну відокремлюють від β-галактозидази (інсулін метіоніну не містить). Потім проводять очистку ланцюгів і їх об'єднання, в результаті чого утворюється нативний дволанцюжкові інсулін. Було показано, що він не містить білків E.coli, ендотоксинів і пірогенних речовин, за фізичними властивостями не відрізняється від інсуліну з підшлункової залози людини і в тест-системі проявляє повну біологічну активність.

Згодом був випробуваний альтернативний метод: синтезували ген молекули-попередника, проінсуліну, який вводили в E.coli. Після очищення проінсуліну його розщеплює трипсином і β-карбоксипептидази і отримали нативний інсулін.

Інсулін людини, отриманий за допомогою E.coli, виявився першим «генно-інженерних білком», випробуваним на людях. У дослідах зі здоровими добровольцями було встановлено, що він безпечний, у всякому разі при короткостроковому застосуванні (не викликає алергічних та інших небажаних реакцій) і володіє практично однаковою з інсуліном свині здатністю знижувати рівень глюкози в крові при введенні його під шкіру і внутрішньовенно. В даний час такий інсулін людини отримують безліч діабетиків у всьому світі. Цьому передували клінічні випробування, в ході яких вивчалися зміни метаболізму та імунологічні ефекти. Сьогодні це вже звичайний метод лікування.

Завдання 2: Виконати лабораторну роботу.

Варіант 1. Гідроліз ДНП дріжджів і виявлення компонентів ДНП в гідролізаті.

Хід роботи. У широку пробірку з повітряним холодильником помістити одну лопаточку сухих дріжджів і додати 10 мл 10% розчину сірчаної кислоти. Помістити пробірку в киплячу водяну баню на 1 ч. Після гідролізат охолодити і провести з ним якісні реакції на складові частини ДНП.

Біуретова реакція на поліпептиди. До 5 крапель гідролізату доливають 10 крапель 10% розчину їдкого натру і 2 краплі 1% розчину сульфату міді. Спостерігається поява рожевої або рожево-фіолетового забарвлення.

Срібна проба на пуринові основи. До 10 краплях гідролізату додають 10 крапель розчину аміаку до лужної реакції, потім 20 крапель 2% аміачного розчину нітрату срібла. При стоянні через 3 - 5 хв. утворюється світло-коричневий осад срібних солей пуринових підстав.

Якісна реакція на пентозу (реакція Троммера). До 10 крапель досліджуваного гідролізату додають 10 крапель 10% розчину їдкого натру і 5 крапель 7% розчину сульфату міді. Обережно нагрівають верхню частину вмісту пробірки до закипання і кип'ятять протягом 1 хв. Спостерігається поява червоного забарвлення.

Молібденова проба на фосфорну кислоту. До 10 краплях гідролізату доливають 20 крапель молібденового реактиву і кип'ятять. При цьому рідина забарвлюється в жовто-лимонний колір. Пробірку охолоджують в струмені холодної води. На дні пробірки з'являється кристалічний лимонно-жовтий осад фосфорномолібденовокіслого амонію.

Варіант 2. Вивчення динаміки зміни концентрації цукру в крові інтактних тварин (кроликів) через 30, 45, 60 хв після введення їм гормону ісуліна.

Інсулін впливає на вуглеводний обмін, і тому отримав назву гіпоглікемічного фактора. Головними мішенями інсуліну є клітини м'язів, печінки, жирової тканини. Рецептори інсуліну локалізовані на поверхні клітин-мішеней і гормон проявляє свою дію, не проникаючи в клітину. Характер дії інсуліну на вуглеводний метаболізм різноманітний. Він підвищує проникність клітинних мембран для глюкози, амінокислот і деяких інших з'єднань. Інсулін підвищує активність гексокінази, глікогенсинтетазу, надаючи в той же час інгібуючу дію на ферменти глюконеогенезу.

Практична значимість. Інсулін - лікарський препарат, який вводять з лікувальною метою, головним чином, при захворюванні на цукровий діабет. Вводять його тільки парентерально, тому що внаслідок своєї білкової природи він інактивується в шлунково-кишковому тракті під дією протеолітичних ферментів. У здорової людини через 20 - 30 хв після введення інсуліну рівень цукру в крові знижується до 50% вихідного, а через 40 хв починає підвищуватися і до 90 - 120 хв досягає норми або навіть злегка перевищує її.

З вушної раковини кролика взяти 0,1 мл крові з метою визначення вмісту цукру в крові до ін'єкції інсуліну.

Вихідний препарат інсуліну, що містить 40 ОД / мл, розвести в 50 разів (0,2 мл інсуліну в 9,8 фізіологічного розчину) і ввести кролику підшкірно в бічну поверхню 0,5 мл отриманого розведення інсуліну, що складе 2 інсулінових одиниці.

Через 30, 45, 60 хв після введення інсуліну з вушної вени кролика брати кожен раз по 0,1 мл крові для визначення рівня цукру в крові орто-толуїдиновим методом. Глюкоза при нагріванні з орто-толуїдини в розчині оцтової кислоти дає зелене забарвлення, інтенсивність якого пропорційна концентрації глюкози:

D-глюкоза + о-толуідін  продукт конденсації зеленого кольору.

Досвідчена проба. У центрифужную пробірку наливають 0,9 мл 3% розчину трихлороцтової кислоти і вносять в неї 0,1 мл крові. Центрифугують протягом 10 хв при 3000 об / хв. Надосадову рідину (центрифугат) зливають в чисту пробірку. Далі 0,5 мл центрифугата вносять в пробірку, додають 2 мл орто-толуїдинового реактиву, закривають скляною пробкою і поміщають в киплячу водяну баню на 8 хв, розвивається зелене забарвлення. Охолоджують під струменем холодної води. Колоріметріруют на фотоелектроколориметри (помаранчевий або червоний світлофільтр) в кюветі 5 мм проти води.

Стандартна проба. Стандартну пробу готують як досвідчену, але замість крові вносять 0,1 мл стандартного розчину глюкози (5,6 ммоль / л), перемішують, відмірюють 0,5 мл цього розчину в нову пробірку, додають 2 мл орто-толуїдинового реактиву, кип'ятять на водяній бані, охолоджують, а потім колориметрируют.

де Сст - концентрація глюкози в ммоль / л в стандартному розчині 5,6 ммоль / л;

Еоп - екстінція дослідної проби;

Їсть - екстінція стандартного розчину.

2. Біотехнологія в 8-ми томах / Под ред. Єгорова Н.С. Самуїлова В.Д. - М. Висш.шк. - тисячу дев'ятсот вісімдесят вісім.

Біотехнологія: отримання лікарських засобів і перспективи розвитку / А.І. Тенцова, Л.М. Брагинцева, Т.К. Устинюк // Фармація: науково-практичний журнал. - М. Медицина. - тисячу дев'ятсот вісімдесят вісім.

4. Біотехнологія: принципи і застосування / Под ред. Хіггінса І. Беста Д. Джонса Дж. - М. Мир. - тисячу дев'ятсот вісімдесят вісім.

7. Лекційний матеріал з біотехнології.

10. Сассон А. Біотехнологія: звершення і надії / Пер. з англ. Мехедова С.Л. Миркина С.М. - М. Мир. - 1 987.

11. Сільськогосподарська біотехнологія: Учеб. / Под ред. В.С. Шевелуха. - М. Вища. шк. - 1988. - 416 с.

Біотехнологічне виробництво рекомбінантного інсуліну.

Створення рекомбінантних білків «другого покоління» на прикладі інсулінів.

Біотехнологічне виробництво інтерферону.

Проблеми стандартизації препаратів інтерферону.

Особливості мікробіологічного виробництва інтерлейкінів.

Перспективи біотехнологічного виробництва інтерлейкінів із застосуванням методів генетичної інженерії.

Мікробіологічний синтез гормону росту людини.

Проблеми конструювання продуцентів гормону росту людини методами генної інженерії.

9. Промислове біотехнологічна виробництво пептидних факторів росту