Забарвлення препарату - практика гістолога
Загальні принципи та методи ФАРБУВАННЯ гістологічних препаратів
В основі фарбування клітин і тканин лежать фізико-хімічні процеси (дифузія, адсорбція, абсорбція, розчинність і ін.), Що відбуваються як в барвнику, так і в мікроструктурах. Велике значення мають щільність тканини і дисперсність барвника, які визначають послідовність і швидкість фарбування.
Метою фарбування є більш виразне виявлення різних компонентів клітин і тканин. Деякі барвники забезпечують цей ефект, розчиняючись в виявлених компонентах, наприклад нейтральних жирах. Інші барвники викликають хімічну реакцію, наприклад виявлення заліза з утворенням берлінської блакиті в кислому середовищі. У багатьох випадках процес фарбування можливий тільки при наявності протрави, наприклад гематоксилин забарвлює тканину в присутності солей металів.
У гістологічної практиці застосовують основні, кислотні і нейтральні барвники.
Основні, або ядерні, барвники - це підстави або їх солі, які забарвлюють структури кислої природи (хроматин ядер, ядерце і ін.) І називаються базофільними (гематоксилін, метіонін, кармін, метиловий зелений і ін.).
Кислотні барвники - це кислоти або їх солі, за допомогою яких виявляють речовини і структури основної природи (цитоплазматичні структури клітин, еритроцити і т.д.). Такими є еозин, кислий фуксин, конго червоний (конгорот), еритрозин.
Нейтральні барвники: судан III, судан IV, метиленовий синій.
Процес гістологічного фарбування умовно поділяють на прогресивний і регресивний, прямий і непрямий, простий і складний. При прогресивному типі фарбування процес йде до тих пір, поки не досягається інтенсивне проникнення барвника в тканину. Регресивний тип визначається за заданим перефарбування структур з наступною диференціюванням до потрібного рівня. Якщо розчин барвника безпосередньо діє на тканину, то говорять про пряме фарбуванні. Фарбування після попередньої підготовки тканини (протруювання) називається непрямим. Фарбування одним барвником - просте. а при використанні декількох барвників - складне.
ПОПЕРЕДНЯ ПІДГОТОВКА зріз до фарбування
Парафінові або целлоидин-парафінові зрізи перед окра-Шивані звільняють від парафіну за допомогою будь-якого його рас-творителя - бензолу, толуолу, ксилолу, бензину. Особливо ретельно видаляють парафін перед дослідженням тканини в поляризаційному мікроскопі, так як парафін володіє двоякопреломляющіе властивістю. Депарафінірованіе здійснюють за такою схемою,
Після депарафінірованія 100-150 препаратів реактиви потрібно міняти. Депарафінірованние препарати готові до фарбування відразу ж після промивання в дистильованій воді, але щоб уникнути відклеювання зрізів, особливо при фарбуванні по Ван-Гизону, їх краще підсушити на повітрі. Якщо фарбування виробляють не відразу, то Депарафінірованние і висушені препарати акуратно, щоб не пошкодити зрізи, складають в коробки і забарвлюють в міру необхідності.
ЗАУВАЖЕННЯ ЩОДО ФАРБУВАННЯ
При фарбуванні водними барвниками зрізи переносять в барвник з дистильованої води, а при фарбуванні спиртовими - з відповідного розчину спирту. Після того як препарат набуває інтенсивне забарвлення, його промивають у воді або спирті для видалення надлишку барвника (диференціювання), контролюючи цей процес під мікроскопом.
Зрізи тканин після целлоідіновой і парафіну та заливки, а також отримані на заморожувати мікротому фарбують в широкогорлих бюксах або на часових стеклах. Одночасно фарбують кілька зрізів, але промивають, диференціюють і т.д. кожен зріз окремо.
Препарати можна поміщати в фарбувальний розчин в спеціальних контейнерах, призначених для одночасного фарбування великої кількості стекол. Якщо препаратів трохи, то раціональніше барвник наносити безпосередньо на зріз по краплях за допомогою піпетки. Залишки барвника можна злити в склянку і використовувати повторно. Д. Киселі (1962) пропонував накривати при цьому зрізи скляним ковпаком, а для зволоження середовища залишати під ковпаком змочену водою вату.
Просвітлення і ВИСНОВОК зріз
Одним з основних умов, що визначають придатність гістологічних препаратів до мікроскопічного дослідження, є їх прозорість. Крім того, препарати повинні бути захищені від висихання і забруднення. Все це забезпечується просвітленням і висновком в спеціальні середовища, які можна поділити на змішуються з водою (гліцерин, гуміарабік, полівініловий спирт, желатин) і не змішуються з водою (ксилол, толуол, їх суміші з фенолом, ефірні масла).
Змішуються з водою просвітлюючі речовини одночасно є середовищем для укладення та приготування постійних препаратів.
Висновок в середовища, що змішуються з водою
З цих середовищ частіше застосовують гліцерин-желатин. Використовують також чистий гліцерин, однак цей метод не дозволяє готувати постійні препарати.
Р. Ліллі рекомендує для цих цілей гума-сироп апатії:
чистий гуміарабік 50 г
цукор-рафінад 50 г
дистильована вода 50мл
Суміш розчиняють на водяній бані при постійному помішуванні, потім додають 500 мг тимолу. Використовують також полівініловий спирт.
Середовища, що змішуються з водою (крім гліцерину), попередньо нагрівають на водяній бані, капають нагрітої скляною паличкою або піпеткою на розправлені зріз, злегка підсушують і покривають чистим і сухим покривним склом. Чистій скляній паличкою або знежиреним пальцем злегка притискають покривне скло. При цьому надлишки середовища видавлюються і їх акуратно видаляють чистою тканиною.
Просвітлення препаратів і висновок в середовища,
смешивающиеся з водою
Зрізи або наклеєні на скло препарати ретельно зневоднюють в спиртах (70%, 96% і 100%), а потім поміщають в будь-які з просвітлюють речовин. Встановлено, що для різних досліджень краще ту чи іншу просвітлює речовина. Так, при фарбуванні по Нісль і Грамом - Вейгерта кращим просвітлює і одночасно диференціюються засобом є анілінові масло, але для просвітлення препаратів при фарбуванні по Ван-Гизону використання його неприпустимо. Найбільш поширеними і індиферентними по відношенню до барвників речовинами є толуол і ксилол. а також їх суміші з фенолом (кристалічний фенол розплавляють в термостаті при 56 ° С і змішують з ксилолом в пропорції 1: 4 або 1: 6).
Добре зневоднені в спиртах і просвітлені в карбол-ксилолі, а потім в чистому ксилоле препарати готові до укладення в спеціальні смоли. З цією метою застосовують смоли рослинного походження - бальзами (канадський, ялицевий і сибірський кедровий). Всі вони добре розчиняються в толуолі і ксилоле.
Метод розчинення: в склянку з сухої смолою заливають толуол, який поступово розчиняє верхні шари смоли. Процес можна прискорити, якщо склянку помістити в термостат при 37 - 40 «С. Отриманий густий розчин зливають в іншу банку і додають нову порцію толуолу, одночасно перемішуючи розчин і доводячи до консистенції рідкого меду. Занадто рідкий розчин у міру випаровування толуолу знову загусає. Приготований бальзам зберігають в щільно, закритому посуді.
У практичній патоморфологии широко використовують синтетичну пластмасу - полістирол. Спосіб застосування цього пластичного матеріалу запропонований Д.С. Саркісова і докладно викладено в керівництві Г.А.Меркулова «Курс Патологогістологіческое техніки» (1969). Полістирол добре розчиняється в ксилолі і толуолі, прозорий і швидко твердне під предметним склом, утворюючи найтоншу плівку. Метод розчинення той же, що і для смол рослинного походження. Однак з часом полістирол стає крихким, в плівці з'являються тріщини. що ускладнює мікроскопічне дослідження і абсолютно неприйнятно для мікрофільмування. Для запобігання цих недоліків в 30% розчин полістиролу в ксилолі додають пластифікатор, що надає плівці еластичність і гнучкість, усуваючи всі недоліки полістиролу. В даний час в якості пластифікатора використовують дибутилфталат, широко застосовуваний в електронній мікроскопії. Існує кілька варіантів приготування полістиролу для укладення препаратів:
1) 94 мл 30% розчину полістиролу в ксилолі змішують з 6 мл дибутилфталата;
2) суміш, що складається з 100 г полістиролу, 100 мл ксилолу та 12 мл дибутилфталата, розчиняють при 22 ° С або в термостаті при 37 ° С, періодично перемішуючи.
Готову синтетичну смолу зберігають в щільно закритому посуді. Технологія укладання зрізів та ж, що і при застосуванні водорозчинних середовищ.
Ядерні барвники ТА ЇХ ПРИГОТУВАННЯ
Фарбування ядер клітин обумовлено двома механізмами хімічної взаємодії: 1) основні барвники, наприклад анілінові, утворюють солі в присутності ДНК і РНК; 2) утворюються комплекси з іонами металів при застосуванні протрави. У практичній роботі частіше використовують протравні барвники. До них відносяться гематоксилин, кармін, сафранін, галлоціанін, алізарин. Добре забарвлюють ядра такі барвники, як янус зелений, основний коричневий, оксазінових барвники (крезіловий фіолетовий, нільський блакитний), тіанін, АЗУРИТ, метиленовий синій, основний фуксин, метиловий зелений і ін. Слід згадати про добрі результати забарвлення ядер соком чорниці, яка запропонована М.Д. Лавдовскій ще в 1887 р
Гематоксилін і способи його приготування
Гематоксилін має рослинне походження: його отримують з ефірного екстракту кампешевого дерева. Гематоксилін добре розчиняється в спирті і погано у воді. Фарбувальними властивостями володіє продукт окислення гематоксиліном - гематеін, тому барвник стає придатним тільки після дозрівання - окислення, на яке потрібно від 10 днів до 2 - 3 тижнів. Дозрівання можна прискорити за допомогою солей алюмінію, хрому, заліза та ін.
Гематоксилін кристалічний 2гр
Дистильована вода 100мл
Алюмокалієві або квасці галун 3г
Крижана оцтова кислота 10мл
Гематоксилін розчиняють в спирті, а галун - в дистильованої воді, змішують обидва розчини і потім додають інші компоненти. Розчин періодично перемішують. Через 10-14 днів він набуває темно-вишневий колір, що свідчить про готовність барвника. Тривалість фарбування гематоксиліном Ерліха 4 - 6 хв. За нею йдуть Промивання в дистильованої, потім у водопровідній воді, Диференціація в 1% солянокислом спирті, відновлення в аміачної воді і остаточне промивання в дистильованій воді.
Для приготування солянокислого спирту до 100 мл 70% спирту додають 1 мл концентрованої соляної кислоти; для приготування аміачної води до 50 мл дистильованої води додають 2 краплі міцного аміаку.
Результат: ядра клітин (оболонка, хроматин) темно-сині, ядерний матрикс блідо-блакитний або прозорий.
Змішують розчини I і II, потім додають 60 мл гліцерину і 2,5 г оксиду ртуті (червоної або жовтої). Розчин нагрівають до 100 ° С, охолоджують, фільтрують. Перед використанням до 100 мл розчину додають 2 мл крижаної оцтової кислоти. Перевагами гематоксиліном Гарріса є швидкість приготування і чіткість забарвлення ядер.
Тривалість фарбування 3 - 4 хв. За нею йдуть промивання і диференціювання, відновлення в аміачної воді і остаточне промивання в дистильованій воді.
Результат: ядра яскраво-сині.
Гематоксилін Маллорі (водний).
Гематоксилін кристалічний 2,5 г
Алюмоаммонійниє галун 50г
Дистильована вода 1000мл
Розчин витримують 10 діб при 25 ° С, додають 440 мг перманганату калію і 2,5 г тимолу. Перемішують кілька разів, перед фарбуванням фільтрують.
Тривалість фарбування 3 - 4 хв. За нею йдуть ті ж процедури, що і при фарбуванні гематоксиліном інших модифікацій.
Результат: ядра сині.
Свіжі чисті ягоди чорниці розминають в ступці, змішують з рівним об'ємом 96% спирту, настоюють 1 - 2 діб і фільтрують. Перед фарбуванням частина розчину розводять рівною кількістю 2% водного розчину алюмокалієвих квасцов і додають 2 - 3 кришталика тимолу.
Тривалість фарбування 5 - 7 хв. За нею йдуть промивання в дистильованій воді, диференціювання в солянокислом спирті, промивання в дистильованій воді, зневоднення, просвітлення і висновок.
Результат: ядра темно-фіолетові.
Фарбування цитоплазми клітин відбувається в результаті зв'язування підстав і білків кислотними барвниками. До групи дифузних (кислих) барвників входять карбонові та сульфоновиє кислоти, нітро-, азокрасители і ін. В гістологічної практиці постійно застосовують еозином, пікринову кислоту, помаранчевий Г, кислий фуксин, конго червоний (конгорот), азокармін, еритрозин. Найчастіше використовують 1% водні розчини цих барвників, але можна застосовувати і 1% спиртовий розчин. Тривалість фарбування коливається від 5 с до 3-5 хв залежно від сорту і серії барвника. Якщо препарат перефарбовується, то надлишок фарби легко видаляється при обполіскуванні в дистильованої воді і подальшому зневоднений-вання препарату або зрізу в спиртах.