Визначення первинної структури білка

ВИЗНАЧЕННЯ ПЕРВИННОЇ СТРУКТУРИ БІЛКА

Визначення первинної структури білка требут попереднього проведення ряду операцій. Білок повинен бути ретельно очищений, чистота матеріалу повинна бути підтверджена як мінімум двома незалежними методами. Найчастіше іспользется гель-електрофорез на поліакриламіді (ПААГ) і ультрацентрифугирование. Після очищення білка його ділять на дві-три або більше частин. Кожну частину обробляють різними ферментам і-протеиназами (трипсин, хімотрипсин) або реагентами (бромціан, іодозобензойная кислота). В результаті отримують два-три (або більше) наборів поліпептидів (відрізків білка). До ферментам- Протеиназа пред'являються особливі вимоги по чистоті, інакше буде утруднено подальше визначення послідовності чергування відрізків пептидів в нативної ланцюга білка. Особливі труднощі становить розпізнавання місць дисульфідних містків між залишками цистеїну. Отримана суміш пептидів розділяється електрофорезом, після чого можливо почати безпосередньо процедуру севенірованія. Довжина окремого пептиду не повинна перевищувати 40 АК-залишків.
Найбільш часто використовуваним методом секвенування пептидів (встановлення послідовності АК-залишків в них) є процедура П. Едмана. з використанням фенілізотіоціаната (ФИТЦ). Процедура лежить в основі роботи автоматичних секвенаторов. Зразок очищеного пептиду наноситься на поверхню реакційного судини у вигляді плівки. Часто здійснюють ковалентное пришивання пептиду з кінця вільної СООН-групи з матеріалом поверхні реакційної посудини. Після чого проводять повторювані цикли з серії реакцій. Одна серія реакцій включає:
- взаємодія ФИТЦ з кінцевим АК-залишком, що має вільну NH2 -группу, при цьому утворюється так зване ФТ К (фенілтіокарбамоіл) -проізводное:
- надлишок ФИТЦ видаляється, змінюється рН середовища додаванням гептафтормасляной кислоти, при цьому відбувається перетворення ФТК в ФТГ (фенілтіогідантоін) -проізводное:
- ФТГ-похідне амінокислоти віддаляється з реакційного середовища екстракцією з 1-хлорбутаном і серія реакцій повторюється в наступному циклі.
За один цикл видаляється один амінокислотний залишок з NH2-краю пептиду. Оскільки, реакції з ФИТЦ протікають не кількісно, ​​а в кращому випадку, на 95 відсотків, поступово накопичуються заважають фактор и- ФТГ-похідні від прореагировавших в попередні цикли АК-залишків. У найсприятливіших випадках вдається надійно ідентифікувати послідовність всього лише близько 40 АК-залишків. Однак, завдяки автоматизації процесу, робота все ж істотно полегшується.

Розшифровка ЗА ДОПОМОГОЮ пептідази:

а) з N-кінцевих залишків за допомогою амінопептидази (хроматографічна ідентифікація і кінетика накопичення відповідних АК.

б) з С-решт за допомогою карбоксипептидази (аналогічно).

ГІДРАЗІНОЛІЗ (в безводному середовищі при 100 град С) за винятком останнього залишку з вільною СООН, все перетворюються в гідразиди кислот:

Порядок чергування пептидів в молекулах білків визначається по перекривання фрагментів пептидів:

G-W-V-RA-O-V-KC-E-C-D триптичного пептиди (трипсин)

G-WV-R-A-OV-K-C-E-C-D хімотріптіческіе пептиди (хімотрипсин)

РЕКОМЕНДОВАНА ЛІТЕРАТУРА:
1. Строєв Є.А. Біологічна хімія. М. +1986.
2. Страйер Л. Біохімія, в 3-х т. М. Світ, 1984.
3. Уайт, Хендлер. Сміт і ін. Основи біохімії, в 3-х т. М. Світ, 1981.
4. Овчинников Ю.А. Біоорганічна хімія, М. Просвещение, 1987.
5. Анісімов та ін. Основи біохімії. М. Вища школа, 1986.