Техніка приготування гістологічних препаратів для світлової мікроскопії

6. приготування зрізів;

8. висновок зрізів.

Коротка характеристика етапів:

1. Взяття матеріалу.

Для гістологічного дослідження беруть шматочки органів і тканин не більшою за 1 см³. Матеріал бажано отримувати якомога раніше після смерті людей (метод дослідження матеріалу трупа людини - аутопсия).

З діагностичною метою матеріал для гістологічного дослідження може забиратися у людей прижиттєво за допомогою спеціальних інструментів або під час операцій. Цей спосіб отримання матеріалу носить назву біопсії.

Взятий для гістологічного дослідження матеріал відразу ж повинен піддаватися фіксації. Фіксація - метод обробки тканини з метою закріплення її прижиттєвої структури. Це досягається шляхом впливу на тканину спеціальних розчинів (фіксаторів). Найбільш суттєвою зміною, що відбувається в тканинах під впливом фіксатора є процес згортання (коагуляції) білків. Кількість фіксатора слід брати в 20-100 разів більше обсягу шматочка фіксованої матеріалу.

Існують фіксатори прості і складні. До простих належать 10-20% розчин формаліну, 96 º спирт, 100 (абсолютний) спирт, 1-2% розчин осмієвою кислоти і ін. Складні фіксатори: спирт - формол (спирт 70º - 100 мл. І формалін 2-5 мл. ) рідина Ценкера (сулема - 5 г, сірчанокислий натрій - 1 р двухромовокіолий калій - 2,5 г, дистильована вода - 100 мл. крижана оцтова кислота 5 мл.) і ін. Тривалість фіксації - від декількох годин до 1 доби і більше в залежності від властивостей фіксатора і характеру досліджуваного матеріалу.

3.Помивка в воді.

Після фіксації матеріал промивають (найчастіше протягом декількох годин в проточній воді) з тим, щоб позбавити його від надлишку фіксатора і різних опадів фіксують рідин.

Вивчити за допомогою мікроскопа такі фіксовані шматочки органів неможливо, тому що вони не прозорі. Щоб шматочок органу можна було микроскопировать, його треба розрізати на дуже тонкі пластинки - зрізи, товщина яких вимірюється в мікрометрів. Такі зрізи отримують за допомогою спеціальних приладів - мікротомів. Але для того, щоб різати на мікротому шматочок тканини, її треба попередньо ущільнити. Це досягається шляхом просочування застигає рідинами - розплавленим парафіном. Парафін в воді не розчиняється, і тому промитий після фіксації шматочок тканини необхідно попередньо збезводнити, і тільки потім насичують.

Зневоднення тканини виробляються поступово (щоб не відбулося сморщивания) шляхом проведення її через спирти зростаючої фортеці: 50º, 60º, 70º, 80º, 90º, 96º, 100º. У кожному спирті шматочки знаходяться від декількох годин до 1 доби в залежності від величини шматочка.

При заливці шматочки попередньо просочуються тими рідинами, які служать розчинниками для парафіну (ксилол або толуол). Заливка в парафін. При заливці в парафін шматочки з абсолютного спирту

переносяться в суміш абсолютного спирту з хлороформом або ксилолом, взятих порівну, потім чистий ксилол і, нарешті, в розплавлений насичений розчин парафіну в хлороформі, де вони знаходяться в термостаті при температурі 37º до 1 доби і більше. Подальша заливка проводиться в термостаті при температурі 54º -56º в трьох порціях парафіну.

Остаточна заливка проводиться в парафін з додаванням воску, який наливають у спеціальні паперові коробочки або скляні чашки, а потім ці коробочки або чашки після появи на поверхні парафіну плівки, занурюють у воду.

Відбувається повне затвердіння парафіну. Шматочки з навколишнім їх парафіном витягують з коробочок і за допомогою розплавленого парафіну, наклеюють на дерев'яні кубики, виходять парафінові блоки.

Ущільнення також можна домогтися заморожуванням шматочка органу (термінова біопсія).

6. Приготування зрізів.

Зрізи з блоків виготовляються на мікротому. Найбільш поширені мікротоми санний і заморожують. У спеціальних пристроях мікротома затискається парафіновий блок і мікротомних ніж. Існує механізм, що піднімає об'ектодержатель з блоком на задану кількість мікрометрів. Це дозволяє при кожному ковзанні ножа в площині паралельної поверхні блоку отримувати зрізи товщиною 5-10 мікрометрів з парафінових блоків.

Виготовлені на мікротому зрізи фарбуються. Перед фарбуванням з парафінових зрізів обов'язково видаляють парафін (розчиненням в ксилолі).

Фарбування необхідно робити для того, щоб чітко виявити під мікроскопом тонкі структури об'єкта. У нефарбованих зрізах більшість структур однаково переломлює світло, тому розглянути їх не вдається.

Виявлення на зрізі гістологічних структур засноване на неоднаковому їх відношенні до барвників. Одні структури зрізу вступають в реакцію з кислими барвниками і ними фарбуються (ацидофільні, оксифільні структури), інші реагують з основними барвниками і фарбуються переважно ними (базофільні структури). Деякі структури фарбуються і кислими і основними барвниками.

За походженням розрізняють фарби природні, до яких відносяться фарби рослинного і тваринного походження, і фарби штучні. Фарбою рослинного походження є гематоксилін, який видобувається з кампешевого дерева, що росте в Америці і в Вірменії. До фарбам тваринного походження відноситься кармін, який видобувається з комах кошенілі, що живуть на кактусових деревах в Мексиці, Вірменії та ін. В даний час більшість фарб готують синтетично (штучні фарби).

По фарбуванню певних гістологічних структур розрізняють фарби ядерні (фарбування ядра), цитоплазматические (фарбують цитоплазму), і спеціальні, що забарвлюють вибірково певні структури.

Ядерні фарби - гематоксилин, кармін, сафранін, метиленовая синь, АЗУР, метіонін. Цитоплазматичні фарби - еозин, пикрофуксином.

Існують спеціальні фарби і реактиви: судан III (забарвлює жир в помаранчевий колір), осмієва кислота (імпрегніруемий нею жир окрашіватся в чорний колір), резорцінфуксін Вейгерта (дає темно-синє забарвлення еластичних волокон), орсеїном (забарвлює еластичні волокна в бурий колір). Метиленовийсиній забарвлює нервові елементи в синій колір, а при імпрегнації сріблом вони набувають коричневого кольору.

Найчастіше для фарбування гістологічних зрізів застосовується фарбування розчином гематоксиліном (приготованим за методом Бемера) і 1-2% еозином.

8. Висновок зрізу.

Пофарбовані і промиті в воді зрізи щоб уникнути помутніння зневоднюють в спиртах (70º, 96º), прояснюють в карбол-ксилолі, ксилолі, а потім на предметне скло, де знаходиться зріз, поміщають краплю бальзаму і зріз накривають покривним склом. Бальзам являє собою розчинену в ксилолі смолу одного з видів сосни, що росте в Канаді (канадський бальзам), смолу ялиці (сибірський бальзам) або спеціальну синтетичну середу.

При дослідженні біопсій з метою уточнення діагнозу в гістологічних лабораторіях вдаються до прискореної обробці матеріалу. Шматочки тканин і органів при цьому проходять ті ж етапи обробки, але за 5-7 днів. Іноді проводиться так звана термінова біопсія, коли протягом 15-80 хв. матеріал фіксує, отримують зрізи, забарвлюють їх і укладають. Швидку фіксацію виробляють в 10% формаліні, який підігрівався полум'ям пальника або з використанням СВЧ-печі. Ущільнення домагаються заморожуванням (хлоретілом, вуглекислотою або за допомогою заморожує мікротома).

Орієнтовна схема забарвлення препаратів гематоксилін - еозином

1. Парафінові або заморожені зрізи доводять до води.

2. Забарвлення гематоксиліном - протягом 3-5 хвилин.

3. Промивання у воді - 2 хвилини.

4. Диференціація в спирті, подкисленном соляною кислотою (1% розчин соляної кислоти в 70% спирті), кілька секунд з наступним відновленням підлуженою водою (близько 1 хвилини). Цей етап бажаний, але не обов'язковий.

5. Промивання у проточній воді.

6. Ополіскування дистильованою водою.

7. Забарвлення 1% еозином - 1-2 хвилини.

8. Ополіскування дистильованою водою.

9. Зневоднення в спирті - 2хв.

10. Просвітлення в ксилолі - 2 хв

11. Висновок зрізу - крапля бальзаму, покривне скло.