Сучасні методи лабораторної діагностики герпетичних інфекцій

Казмірчук Віра Євстафіївна, доктор медичних наук, професор, директор

Мальцев Дмитро Валерійович, кандидат медичних наук,
заступник директора Інститут імунології та алергології Національного медичного університету імені О. О. Богомольця

1.Вірусологіческій метод. сутність якого полягає у виділенні вірусу в культурах чутливих клітин (наприклад, фібробластів) або курячих ембріонах, як і раніше залишається "золотим стандартом" діагностики вірусних інфекцій людини, оскільки характеризується високою чутливістю (85-100%) і специфічність (100%), дозволяє отримати чисту культуру вірусу для подальшого вивчення, зокрема випробування чутливості до противірусних препаратів. Однак істотна дорожнеча і трудомісткість перешкоджають його широкому впровадженню в повсякденну клінічну практику. Результати вірусологічного методу отримують занадто пізно (від 2-х до 14-ти днів), щоб використовувати таку діагностику при невідкладних станах (наприклад, при вірусному енцефаліті або сепсис).

2.Електронние мікроскопія дозволяє виявити вірусні частки в досліджуваному зразку і визначити видову приналежність віріонів за їх морфологічними ознаками, однак цей метод малодоступний для клінічної практики і використовується в основному в наукових цілях.

3.Біологіческая проба полягає в зараженні чутливих лабораторних тварин (білих мишей або кроликів) біоматеріалом, отриманим від хворого на герпетичну інфекцію; метод може бути використаний в спірних випадках герпесвірусної інфекції, наприклад, для діагностики атипові герпетичного енцефаліту.

а) гібридизація ДНК - високоспецифічний метод, що дозволяє ідентифікувати геном вірусу після його гібридизації комплементарними молекулами ДНК. Метод визначає здатність досліджуваної вірусної ДНК гібридизувати (специфічно зв'язуватися) з меченной комплементарної ДНК відомої природи, на підставі чого робиться висновок про видову приналежність досліджуваного зразка. Специфічність зазначеного методу прямо пропорційна довжині комплементарної полинуклеотидной ланцюжка. В якості маркера застосовують ферменти (наприклад, пероксидазу, лужну фосфатазу) або ізотопи. Крім того, для виявлення феномена гібридизації проводять електрофорез в гелі, що дозволяє диференціювати електрофоретична рухливість комплементарної ДНК і комплексу "комплементарная ДНК - ДНК вірусу".

б) полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - найбільш широко використовуваний сьогодні метод діагностики герпетичних інфекцій людини, який запропонував Мюлліса в 1983 році. В основі методу лежить каталізуемое ферментом ДНК-полімеразою багаторазове освіту копій (ампліфікація) певної ділянки ДНК, що представляє діагностичний інтерес. При цьому для ампліфікації, тобто синтезу ДНК-матриці, відбирають найбільш консервативну частину вірусного генома, звичайно який-небудь унікальний ген, який найбільш чітко відрізняє його від інших патогенів. Етапи методу:

1) термічне розділення двухнитевой молекули ДНК на окремі ланцюжки (30-40 с при 93-95 о С);

2) охолодження середовища;

3) внесення видоспецифических праймерів. тобто фрагментів ДНК, комплементарних нуклеотидних послідовностей обох ланцюжків ДНК досліджуваного збудника; для запуску синтезу на ДНК-матриці використовують 2 праймера, які є комплементарними ниткам ДНК на обох кінцях специфічного фрагмента;

4) внесення термостабільної ДНК-полімерази, що запускає утворення вторинних копій ланцюгів ДНК;

5) повторний підігрів;

6) охолодження середовища;

7) повторне внесення праймерів;

8) повторення процедур підігріву і охолодження;

9) після 30-80 циклів накопичення копій ДНК проводять їх ідентифікацію шляхом електрофорезу або імунофлуоресцентний методом [31].

Взаємодія праймерів з ДНК-полімеразою і ДНК-матрицею називається відпалом. оскільки реакція відбувається за 20-30 с при 50-65 о С. В результаті добудовування ланцюгів ДНК в специфічному фрагменті під дією ДНК-полімерази формується специфічний фрагмент - амплікон. Таким чином, амплікон складається з ланцюга ДНК-матриці, праймера і добудованого до нього за допомогою ДНК-полімерази фрагмента полінуклеотидних ланцюга. Як зазначалося вище, після закінчення першого циклу проводять повторні, а синтезовані в них амплікона служать матрицями для наступних етапів. При цьому розраховано, що за 30-40 циклів з однієї матриці можна отримати біля 10 8 амплікон (рис. 1).

Мал. 1. Принципова схема постановки ПЛР

Розрізняють якісний. Напівкількісний і кількісний варіанти методу. При проведенні якісної ПЛР можна визначити лише факт присутності вірусу, однак неможливо оцінити його репродуктивну активність, що є неприйнятним при діагностиці герпетичних інфекцій, при яких необхідно проводити диференційний діагноз між латентними, персистирующими і ре формами інфекції. Напівкількісна ПЛР дає певну інформацію про зміст копій вірусних ДНК, яка виражається у вигляді умовних позначень (+, ++, +++, ++++), однак найбільш доцільно проводити саме кількісний варіант методу, при якому можна отримати точні числові значення.

Треба розуміти, що отриманий кількісний результат не відповідає справжньому змісту ДНК збудника в досліджуваній пробі через феномена ампліфікації, який має місце при проведенні ПЛР. Однак все ж є певна пропорційність між вихідним кількістю генетичного матеріалу і кінцевим результатом дослідження, яка дотримується лише в разі проведення діагностики в стандартних умовах з використанням одних і тих же реактивів. Тому такі дані можна застосовувати в клінічній діагностиці, якщо проводити обстеження пацієнта в динаміці в одній і тій же лабораторії. Якщо ж необхідно встановити абсолютну кількість вірусної ДНК в пробі, то проводять нормалізацію отриманих результатів (порівняння з кількістю продуктів деяких стабільних генів, експресія яких однакова при різних умовах).

ПЛР враховує основні недоліки методу гібридизації ДНК, зокрема характеризується підвищеною чутливістю, що пов'язано зі штучним підвищенням вмісту вірусної нуклеїнової кислоти в досліджуваному матеріалі. Також за рахунок проведення цієї реакції істотно прискорюється час отримання результату.

ПЛР - високоточний метод; теоретично для отримання результату досить мати в середовищі всього одну молекулу ДНК збудника. Чутливість ПЛР становить 98%, а специфічність - 94%. Помилково негативні результати можливі при недотриманні технологічних процедур проведення дослідження, а також при використанні неякісних реактивів. Хибно позитивні дані можна отримати при підрахунку результатів методом електрофорезу, що пов'язано з контамінацією повітряного середовища робочого простору амплікона, отриманими в ході попередніх постановок. Тому використання так званих відкритих методик підрахунку результатів вимагає проведення інтенсивної вентиляції приміщень. Набагато краще використовувати закриті методики підрахунку, наприклад, імунофлуоресцентний детектори, при яких немає прямого контакту між продуктами реакції і повітряним середовищем, а результати дослідження є більш коректними.

Найбільш точною є методика так називаемойreal-timeПЦР. тобто ПЛР в реальному часі. Її відмітною властивістю є підрахунок кількості ампліфикувати ДНК у міру їх накопичення після кожного ампліфікаціонних циклу, а не в кінці постановки. При цьому використовуються дві методики реєстрації результатів: за допомогою флуоресцентних "фарб". які безпосередньо взаємодіють cдвуцепочечной ДНК і забезпечують її світіння, і модіфіцірованнихДНК-олігонуклеотидних проб (рис. 2, 3). Останні містять специфічні послідовності ДНК, комплементарні унікальним генам досліджуваного патогена, а також флуорофор і "гаситель" (quencher), приєднані до молекули-носія, званої reporter ( "переносник"). Флюорофор від'єднується від "гасителя" і забезпечує феномен світіння тільки після гібридизації специфічних олігонуклеотидних послідовностей з комплементарної досліджуваної ДНК.

Навіть кількісна ПЛР не завжди дозволяє адекватно розмежувати латетние і ре інфекції, так як в обох випадках має місце наявність вірусної ДНК. Для подібної диференціальної діагностики використовують ПЛР зворотної транскрипції (reversetranscription PCR), за допомогою якої можна підрахувати кількість вірусної мРНК, яке вказує на інтенсивність експресії вірусних генів. Висока кількість мРНК патогена свідчить про реактивировать інфекції.

1 - интактная проба (гаситель і флюорофор пов'язані один з одним); 2 - проба гібрідізіруют з комплементарної ниткою досліджуваної ДНК; 3 - під впливом ДНК-полімерази проба руйнується і флюоресцент вивільняється (ефект світіння)

Розділ книги В.Е. Казмірчук, Д.В. Мальцев

"Клініка, діагностика, лікування герпесвірусних інфекцій людини"