Сиквенс генома людини

Сиквенс генома людини. Стратегія сиквенсу генома людини. Фінгерпрінт клону.

Поняття «чорновий варіант» перш за все відноситься до того факту, що сиквенс не безперервний - в ньому є проломи.

Оскільки таких проломів досить багато, то неможливо розташувати по порядку і орієнтувати багато дрібних секвенований послідовності.

Неповнота сиквенсу. природно, поки створює проблеми для ідентифікації генів спадкових хвороб, унікальних генів і інших генетичних структур.

Слід зазначити, що за останню чверть XX ст. були секвенувати геноми 599 вірусів і віроідов, 205 плазмід, 185 органел, 31 еубактеріі, 1 виду грибів, 2 видів тварин і кілька інших геномів. Досвід, накопичений в результаті цієї роботи, був повною мірою використаний при секвенування генома людини.

Стратегія сиквенсу генома людини в громадському проекті включала в себе отримання генетичної та фізичної карти геному людини, подальше введення в ці карти результатів сиквенсу окремих клонів геномної ДНК (стратегія сиквенсу «клона за клоном»). Такий підхід, на думку організаторів програми, дозволяє уникнути помилок в сиквенс, особливо в областях повторів.

Фізична карта людського генома має клепальну основу, яка була розроблена Olson ще в 1981 р Підхід полягає в наступному. Геном розрізався на сегменти, що містять по 150 000 пар основ за допомогою часткового перетравлення сайтспецифической ендонуклеаза. Ці великі сегменти ДНК поміщали в штучні бактеріальні хромосоми (ВАС) і вводили в бактерії, де вони копіювалися при кожному діленні бактерії. В результаті утворилися клони ідентичних молекул ДНК.

Таких клонів, що перекривають геном людини, повинно бути приблизно 20 000. Кожен клон повністю перетравлюється рестрикційних ендонуклеаз, відібраної для отримання характерного патерну малих фрагментів, або фінгерпрінт клону.

Порівняння патернів сайтів рестрикції дозволяло виявити перекривання між клонами, що дало можливість встановити їх взаємне розташування і вибудувати по порядку. Крім того, для встановлення порядку клонів використовували раніше розроблені карти STS (див. Вище). В результаті вийшла фізична карта геному.

Окремі ВАС-клони розрізали на фрагменти і клонувати. Отримані в результаті клонування фрагментів субклони секвенували. Кожен раз сек-веніровалі велике число однакових субклонов, щоб бути впевненим в тому, що кожен фрагмент оригінального ВАС-клона проаналізовано кілька разів і при цьому не допущено помилок.

Сиквенс окремих фрагментів об'єднували з тим, щоб отримати послідовність нуклеотидів в кожному вихідному ВАС-клон. Нарешті, сиквенс всього генома збирали шляхом з'єднання сіквенсів набору ВАС, що перекривають весь геном.

Створена таким чином карта сиквенсу генома людини має більше 1000 розривів. Це може бути пов'язано з рядом причин, зокрема з тим, що вихідні ВАС-клони не перекривали весь геном, а також перекриття між клонами було пропущено через присутність великих повторів в геномі. Створена в результаті реалізації проекту карта сиквенсу включає послідовності, що містять в середньому кілька мільйонів пар нуклеотидів в довжину.

Сегменти такої довжини достатні, щоб карту, засновану на клонах, накласти на інші карти з меншим дозволом. Для цього була використана FISH-гібридизація in situ ВАС-клонів. Положення на генетичній карті секвенувати послідовностей визначали також щодо картірованних STS.

Загалом секвенований і зібрано за допомогою комп'ютерних програм в протяжні ділянки близько 90% еухроматінових районів геному. Закінченим, однак, можна вважати сиквенс тільки для приблизно 1/4 генома, в якому кожна пара підстав секвенований в середньому 8-10 разів (припускають, що така кількість повторів сиквенсу кожного нуклеотиду буде досягнуто в остаточному сиквенс для всього генома людини). Незважаючи на неповноту сиквенсу, цілий ряд отриманих з його допомогою результатів уже зараз представляє безперечний інтерес. Це стосується в першу чергу до поглиблення наших глобальних уявлень про організацію геному людини.