Реплікація нуклеїнових кислот - студопедія

Основною функцією ДНК є її здатність до Самоудвоение (реплікації). Реплікація - дуже точний механізм, практично не допускає помилок. У самій ДНК (у деяких вірусів - в РНК) закодована інформація про структуру ферментів, які здійснюють подвоєння нуклеїнових кислот, синтез нових нуклеотидів - будівельну базу реплікації, виправлення помилок реплікації, а також репарацію пошкоджень ДНК, викликаних різними факторами. Нарешті, сама структура ДНК, а саме наявність двох ланцюгів в її складі, є умовою, що полегшує процес копіювання, оскільки в такому випадку кожна з ланцюжків може виконувати роль матриці при синтезі нових молекул ДНК. Подібне припущення висловили Джеймс Уотсон і Френсіс Крік ще в 1953 р і воно отримало експериментальне підтвердження. Такий механізм копіювання ДНК, коли кожна з ланцюгів виконує функцію шаблону, а знову синтезовані молекули є гібридними (складаються з однієї старої і одній новій ланцюгів), називається напівконсервативним.

Крім напівконсервативної, були запропоновані ще дві моделі реплікації: консервативна і дісперсівний. Особливості цих моделей реплікації ДНК полягають у наступному. Згідно дісперсівний моделі, батьківська спіраль ДНК при подвоєнні розривається на кожному півоберту шляхом множинної фрагментації, а синтез нових ланцюгів відбувається на фрагментах (рис. 1.9). За консервативної моделі розкручування спіралі ДНК не відбувається зовсім, і вона служить матрицею для двох нових ланцюгів, в результаті чого батьківська спіраль цілком складається зі старого, а дочірня - з нового матеріалу. Доказ реальності напівконсервативним механізму реплікації ДНК надали Месельсон і Сталь в 1958 році в експериментах з ультрацентрифугирование міченої бактеріальної ДНК.

Суть цих експериментів полягала в наступному: ДНК E.coli мітили радіоактивним ізотопом 15 N, а потім давали здійснитися одному раунду реплікації ДНК, вирощуючи клітини протягом

50 хв на живильному середовищі, що містить нормальний ізотоп азоту - 14 N. Виділену з клітин ДНК піддавали ультрацентрифугирование в градієнті щільності хлористого цезію. При такому центрифугировании молекули CsCl створюють в пробірці градієнт щільності, і молекули інших речовин розподіляються в цьому градієнті у відповідності зі своєю щільністю. ДНК E.coli, вирощених на середовищі, що містить 15 N, має щільність 1,724 г / см 3. тоді як ДНК клітин, вирощених на звичайному середовищі з ізотопом 14 N, характеризується щільністю 1,710 г / см 3. Таким чином, суміш цих двох типів ДНК легко розділяється при центрифугуванні по щільності. Локалізацію ДНК в пробірці з градієнтом CsCl можна визначити по поглинанню ультрафіолетових променів (ДНК поглинає випромінювання з довжиною хвилі 260 нм). Таким чином, ДНК в пробірці виявляється у вигляді «смуг» - «легка» у верхнього краю пробірки, «важка» - ближче до дна. В даному експерименті в пробірці з градієнтом хлористого цезію утворилася всього одна, середня за «тяжкості» смуга, положення якої відповідало гібридної ДНК, що включає обидва ізотопу азоту - 15 N і 14 N. Ця обставина виключало можливість реалізації тільки однієї моделі реплікації ДНК -консерватівной. Для вибору між двома іншими моделями реплікації Месельсон і Сталь дозволили бактеріям, ДНК яких містила обидва ізотопу, зробити ще одну поділку на середовищі з 14 N. Потім їх ДНК знову піддали ультрацентрифугирование. На цей раз в пробірці сформувалося дві смуги ДНК - «легка» і середня по «тяжкості», що підтверджує справедливість напівконсервативним механізму реплікації ДНК.

Отже, всі вивчені до теперішнього часу способи реплікації нуклеїнових кислот зводяться до напівконсервативним механізму, згідно з яким після кожного раунду реплікації одна нитка в кожній з двох дочірніх молекул є батьківської, т. Е. Консервативної, а інша - синтезованої заново. Реплікація одно- і дволанцюжкових нуклеїнових кислот, що представляють геноми різних організмів, здійснюється з дотриманням певних закономірностей при реалізації різних механізмів, які розглянуті нижче. Загальним для всіх цих процесів є: 1) участь складного комплексу ферментів, які здійснюють реплікацію; 2) наявність трьох основних стадій процесу - ініціації, елонгації та термінації; 3) дотримання принципу комплементарності при побудові нових ланцюгів, при якому шаблоном (матрицею) служить батьківська ланцюжок; 4) висока точність процесу; 5) можливість виправлення помилок реплікації в ході коректорській правки.

Реплікація дволанцюжкових ДНК. Дволанцюжкові ДНК формують геноми всіх клітинних організмів - і прокаріот і еукаріот. Найкращим чином механізм реплікації ДНК вивчений по відношенню до прокаріотів клітин, зокрема бактерій E.coli. В експериментах з прокариотами показано, що в умовах, які обмежують синтез білка, реплікація ДНК не відбувається, з чого можна зробити висновок, що цей процес потребує участі білків. В даний час показано, що в процесі реплікації ДНК беруть участь продукти більш ніж 10 генів. Це, в першу чергу, ДНК-полімерази. а також топоізомерази. гелікази і лігази. З'являється все більше даних на користь участі в процесі реплікації ДНК високоорганізованого мультиферментного комплексу -реплісоми. що включає праймосомой-Праймазная комплекс, гелікази, Pol III-холоферменту і гірази.

ДНК-полімерази - це ключові ферменти репликативного процесу, які власне і здійснюють нарощування полінуклеотидних ланцюгів, використовуючи принцип комплементарності. Найбільш повно вивчені ДНК-полімерази кишкової палички. У клітинах цих бактерій виявлено три різних типи ДНК-полімерази (Pol-I, Pol-II і Pol-III), які розрізняються в першу чергу швидкістю каталізу і нуклеазного активністю. ДНК-полімераза I (Pol-I) є одиночним поліпептид, що містить близько 1000 амінокислотних залишків. У клітці E.coli налічується близько 400 молекул цього ферменту. Pol-I має наступні активностями: полімеразної - приєднання комплементарних матричної ланцюга дезоксинуклеотидов до вільної 3'-ОН-групі праймера в напрямку від 5'до 3'-кінця (5 '→ 3') будується молекули ДНК; екзонуклеазной - гідроліз фосфодіефірних зв'язків (відщеплення нуклеотидів) в одного ланцюга ДНК або на неспареними кінці дуплексной ДНК, починаючи з 3ў-кінця ланцюга (3 '→ 5') і 5'-кінця ланцюга (5 '→ 3'). Екзонуклеазние активності грають дуже велику роль в реплікації і репарації хромосомної ДНК E.coli. 3 '→ 5'-екзонуклеазная активність забезпечує контроль за приєднанням кожного нуклеотиду і видалення помилкових нуклеотидів з зростаючого кінця ланцюга (коректорська правка), а 5 '→ 3' екзонуклеазная активність використовується для видалення димарів пиримидинов і рибонуклеотидов фрагментів Окадзакі.

ДНК-полімераза II (Pol-II) присутній в клітинах кишкової палички в значно меншій кількості копій і здійснює полимеразную активність набагато повільніше, ніж Pol-I (становить тільки 5% активності ДНК-полімерази I). На відміну від Pol-I цей фермент не має 5 '→ 3' екзонуклеазной активністю. Роль цієї полімерази в реплікації до кінця не з'ясована. Вважається, що цей фермент не обов'язковий для реплікації ДНК, але може замінювати окремі функції Pol-I при її пошкодженні.

ДНК-полімераза III (Pol-III) - основний фермент, відповідальний за реплікацію хромосомальной ДНК E.coli. У кожній клітині міститься лише 10-20 молекул цього ферменту, але працює він приблизно в 60 разів швидше ДНК-полімерази I. Крім того, Pol-III володіє підвищеною спорідненістю до матриці і забезпечує більш високу ефективність копіювання. Для даного ферменту, так само як і для Pol-II, не притаманна 5 '→ 3' екзонуклеазная активність. Тому для реплікації відстає ланцюга необхідна участь Pol-I, щоб відбулося видалення РНК-праймерів на 5'-кінці фрагментів Окадзакі.

У клітині виявлено більшу кількість ДНК-полімерази, але їх функції вивчені гірше.

Функція топоізомераз зводиться до вирішення механічних і топологічних проблем в процесі розкручування подвійної спіралі в репликативной вилці. Ці ферменти змінюють ступінь сверхспіралізаціі і призводять до утворення «шарніра», який створює умови для безперервного руху реплікативної вилки. У різних організмах ідентифіковані топоізомерази двох основних типів: топоізомерази типу I надрізають одну з двох ланцюгів, в результаті чого кінцева ділянка подвійної спіралі може обернутися навколо интактной ланцюга, і потім возз'єднують кінці розрізаної ланцюга. Топоізомерази типу II вносять тимчасові розриви в обидві комплементарні ланцюга, змінюють ступінь сверхспіралізаціі, а потім з'єднують розірвані кінці.

Гелікази здійснюють освіту і просування вздовж спіралі ДНК репликативной вилки - ділянки молекули з розплетеними ланцюгами. Ці ферменти використовують для розплітання ланцюгів енергію, що вивільняється при гідролізі АТР. Для забезпечення більш високої швидкості розкручування кілька геліказу діють в комплексі з білками другого типу, які зв'язуються з одноланцюжковий ділянками молекули і тим самим стабілізують розплітання дуплекс.

Нарешті, ДНК-лігази каталізують процеси возз'єднання фрагментів ланцюгів ДНК, беручи участь в утворенні ковалентних зв'язків (фосфодіефірних містків) між 5'-P- і 3'-ОН-групами сусідніх дезоксирибонуклеотидов. Ці ферменти також використовують енергію макроергічних зв'язків, що утворюється при гідролізі АТР або GTP.

Елонгація реплікації ДНК. Синтез нових ланцюгів ДНК здійснюється з дотриманням принципу комплементарності: кожен підбирається в зростаючу ланцюг нуклеотид повинен бути комплементарен відповідному (розташованому навпроти) нуклеотиду в вихідної (матричної) ланцюга.

Оскільки все ДНК-полімерази здійснюють процес полімеризації нуклеотидів тільки в одному напрямку (5 '→ 3'), а репликативная вилка рухається уздовж ДНК в обох напрямках, безперервно синтезуватися в кожному з напрямків може лише одна нитка, яку називають лідируючої. Друга (протилежна) нитка синтезується короткими фрагментами (фрагменти Окадзакі) і називається відстає (рис. 1.10). Фрагменти Окадзакі у прокаріот містять близько 1000 нуклеотидів, а у еукаріот - 100-200 нуклеотидів.

Крім полімеризації ланцюгів, яку здійснює в основному ДНК-полімераза III, в процесі реплікації ДНК відбуваються такі події:

- вирізання РНК-запалів з лідируючої ланцюга і з кожного фрагмента Окадзакі. Цю функцію виконує Pol-I за допомогою своєї 5 '→ 3' екзонуклеазной активності;

- заповнення "прогалин", що залишилися після вирізання РНК-запалів. Цю роботу також здійснює ДНК-полімераза I, використовуючи вільну 3'-ОН-групу сусіднього фрагмента Окадзакі;

- з'єднання фрагментів ДНК в відстає ланцюга за допомогою ферменту ДНК-лігази: коли зростаючий 3'-гідроксильних кінець кожного фрагмента Окадзакі доходить до 5'-дезоксінуклеотідного кінця сусіднього фрагмента, вступає в дію ДНК-лігаза і утворюється безперервна відстає ланцюг;

- виправлення помилок реплікації - коректорська правка. Цей механізм характерний як для Pol-I, так і для Pol-III і ґрунтується на їх 3 '→ 5'-екзонуклеазной активності. Відомо, що ДНК-полімераза перевіряє компліментарність подбираемого нуклеотиду, контролюючи розмір нової передбачуваної пари нуклеотидів в своєму активному центрі, і її полімеразна активність включається лише тоді, коли ця компліментарність встановлена. З іншого боку, кожен знову вбудований нуклеотид також перевіряється на відповідність своїй парі в активному центрі ферменту. Якщо розмір утворилася пари нуклеотидів не відповідає істинному (коли підстави протилежних нуклеотидів НЕ комплементарні один одному), за допомогою своєї 3 '→ 5'-екзонуклеазной активності фермент вирізає некомплементарни нуклеотид і шукає йому заміну. Додатковим механізмом, що зменшує помилки реплікації, служить репарація ДНК. В результаті частота помилкового включення нуклеотидів в утворюється при реплікації ланцюг ДНК вкрай низька (10 -8 -10 -10).

Термінaція реплікації. При двобічної реплікації кільцевого генома (як у кишкової палички) реплікативні вилки зустрічаються на відстані 180 ° від точки реплікації, і в цьому місці реплікація завершується. Кільцеві ДНК в місці зустрічі з'єднуються лігази, при цьому вони виявляються попарно зчепленими, і в подальшому відбувається їх поділ на окремі геноми за допомогою топоізомерази типу II.

Швидкість реплікації ДНК у бактерій E.coli складає приблизно 1500 пар нуклеотидів в секунду. Таким чином, повний геном кишкової палички (4 * 10 6 п. Н.) Реплицируется приблизно за 40 хв. Однак клітини E.coli діляться швидше - кожні 20 хв, і це означає, що при колишній швидкості копіювання збільшується частота актів ініціації в тій же самій точці початку реплікації. Т. е. Ще до завершення першого раунду реплікації генома в сайті ori ініціюється другий раунд реплікації. Швидкість руху реплікативної вилки в клітині значно менше (10-100 п.н. в секунду), але завершення реплікації в розумний час забезпечується одночасною ініціацією в безлічі точок. В результаті хромосома дрозофіли, наприклад, що містить 6,5 * 10 7 пар основ реплицируется за кілька хвилин.

В цілому закономірності реплікації, виявлені для прокаріотів, характерні і для більшості еукаріотичних геномів. Відмінності полягають, в першу чергу, в наявності у еукаріот безлічі сайтів ініціації реплікації на кожній хромосомі, інших, ніж у прокаріот, механізмах виправлення помилок реплікації, а також в ферментативном оснащенні процесу реплікації. Схематичне зображення процесів реплікації циклічних, які формують геноми прокаріотів і плазмід, і лінійних (еукаріотичних) геномів представлені на рис. 1.11.

У лінійної ДНК розкручування ланцюгів здійснюється шляхом обертання одного ланцюга навколо іншої. В кільцевої ДНК розкручування і реплікація ведуть до утворення структури, що нагадує кільце з внутрішньої петлею. Її називають тета-петлею. оскільки за формою вона схожа на грецьку букву Q. Такі петлі можна спостерігати на радіоавтографах реплицирующихся бактеріальних ДНК, що вперше здійснив Кернс для ДНК E.coli. Наведений механізм двобічної реплікації ДНК є найбільш поширеним, але не єдиним. ДНК фагів Р22, 186, Р2, а також фагів Т4 і l на пізніх стадіях литического циклу реплицируется по односпрямованому механізму (тип кільця, що котиться). В цьому випадку дволанцюжкова кільцева ДНК надрізається специфічним ферментом в унікальному сайті одного ланцюга (точці початку кільця, що котиться). Утворився в результаті надрізу 5'-кінець ланцюга зв'язується з ферментом, який здійснив надріз. Синтез ДНК починається з витіснення 5'-кінця, пов'язаного з ферментом, в розчин, що дозволяє ДНК-полімерази приєднувати нуклеотиди до 3'-ОН-кінця. Відбувається напівконсервативним реплікація, в ході якої 5'-кінець розірваної ланцюга витісняється у вигляді вільного хвоста і його довжина все збільшується, а матрицею служить интактная замкнута ланцюг. Цю реплицирующихся структуру (рис. 1.12) називають катящимся кільцем, так як розмотування вільної одиночній ланцюга супроводжується обертанням двухцепочечной матриці навколо своєї осі.

Якщо цей механізм використовується для реплікації двухцепочечной ДНК, то 5'-кінцеві хвости служать матрицями для синтезу невеликих фрагментів ДНК, які відразу ж зшиваються разом під дією ДНК-лігази. В результаті зростаючі хвости незабаром після свого утворення набувають двухцепочечную структуру. Елонгація хвостів призводить іноді до

тому, що їх довжина багаторазово перевищує загальну довжину вихідної кільцевої молекули. Такий спосіб реплікації використовує, наприклад, фаг l. При упаковці ДНК в капсиди в спеціальних ділянках, які називаються cos-сайтами і віддалених один від одного на довжину вірусного генома, утворюються надрізи, в результаті чого довгі дуплекси багаторазово повтореної фаговой ДНК расчленяются на фрагменти, відповідні за розмірами зрілої ДНК, виявленої в вирионах бактеріофага l . Реплікація за типом кільця, що котиться характерна також для утворення копії бактеріальної хромосоми E.coli Hfr і фактора F +. передаються при кон'югації в реципієнтную клітку.

Реплікація одноланцюгових ДНК. У фагів М13 або fХ174, чиї зрілі геноми представлені поодинокими кільцевими ДНК, реплікація здійснюється за механізмом кільця, що котиться (рис. 1.12). Це відбувається на пізніх стадіях інфекційного процесу, після того, як

інфікуюча ДНК перетворюється в двухцепочечную кільцеву форму. В даному випадку не здійснюється реплікація 5'-кінцевих ділянок, на відміну від реплікації геномів фага l (рис. 1.12, поз. 5), тому продуктом реплікації є довгі поодинокі ланцюга ДНК, постійно відділяються від «котиться рулону» Ці ланцюги надрізають в кожній точці початку реплікації і замикаються з утворенням зрілих кільцевих форм, упаковуваних в капсиди.