Методи культивування вірусів - студопедія

фактори росту. Клітини надзвичайно чутливі до зради-нію рН середовища. Для контролю рН в середовища додають індикатор. Більшість клітинних. культур зростає у вигляді моношару (плас-та, що складається з одного шару клітини), міцно прикріплений до поверхні контейнера для культивування - пробірки, пластикового планшета або матрац) (флакон 4-гранной фор-ми). Деякі типи клітин способи рости також в сусп-зії.

Приготування первинної культти клітин включає-скільки послідовних етапів: подрібнення тканини, роз'єм-єднання клітин шляхом тріпспозіціі відмивання отриманої однорідної суспензії ізольованих клітин від трипсину з подальшим суспендированием клітин в живильному середовищі, що забезпечує їх зростання (наприклад, середовищі 199 з додаванням телячої сироватки крові) . При осіданні клітини досить міцно прикріплюються до стінки пробірки або флакони, по якій поширюються в вигляді моношару. Після отримання моношару життєздатною культури клітин її заражають мате-ріалом, що містить віруси. УПО-мянутие мікроби проникають всередину клітин, де і розмножити-ються. У культурах клітин вдається культивувати більшість вірусів, що викликають захворювання людини.

Внутрішньоклітинні паразити роблять цитопатическое дей-ствие (ЦПД) на клітини, в яких відбувається їх репродукція. ЦПД може проявлятися деструкцією (лізисом) заражених клітин, зміною їх морфології (зміною розмірів і форми самої клітини, появою вакуолей або включень, що представляють собою внутрішньоклітинні скупчення вірусів, утворенням ощцітія) і порушенням їх функцій.

Курячі ембріони. Курячі ембріони в порівнянні з культурами клітин значно рідше бувають контаміновані вірусами, а також володіють сравнітель-но високою життєздатністю і стійкістю до різних впливів. Вони придатні для деяких вірусів, патогенних для людини.

Для отримання чистих культур риккетсий, хламідій і ряду вірусів в діагностичних цілях, а. також для приготування різноманітних препаратів (вакцини, діагностикуми) викорис-товують 8-12-денні курячі ембріони. До недоліків данно-го методу відносяться неможливість виявлення досліджуваного мікроорганізму без попереднього розтину ембріона, а також наявність великої кількості білків і інших з'єднань-ний, що ускладнюють подальшу очистку збудника при виготовленні різних препаратор

Для зараження курячих ембріонів досліджуваний матеріал вводять в аллантоісную і амніотичну порожнини, на хоріон-аллантоісную оболонку або в жовтковий мішок курячого ембріона (рис.). Для зараження в аллантоісную порожнину в шкаралупі над повітряною камерою (межі її заздалегідь обво-дять олівцем при просвічуванні яйця) проробляють НЕ-великий отвір за допомогою ножиць, скальпеля або спеці-ального гвинта. Шприцом вводять 0,1-0,2 мл віруссодержащего матеріалу на глибину 2-3 мм нижче межі воздуш-ної камери. Отвір в шкаралупі заливають розплавленим парафіном. Розтин заражених ембріонів виробляють в терміни максимального накопичення вірусу (через 48-72 год ін-кубаціі при 37 ° С). Після обробки спиртом і 2% розчином йоду шкаралупу розсікають ножицями трохи вище окреслено-ної олівцем кордону повітряної камери, нахиляючи яйце так, щоб уникнути попадання шкаралупи в порожнину. Шкаралупу відкидають, обережно знімають її оболонку і розглядали-ють хоріон-аллантоісную оболонку навколо місця зараження, від-мечая наявність або відсутність вогнищ ураження - геморагії, бляшок і ін. Потім пастерівської піпеткою проколюють хоріон-аллантоісную оболонку в ділянці, вільному від судин , і відсмоктують аллантоісную рідина. Після цього витягують хо-Ріон-аллантоісную оболонку, двічі промивають її изотони-ного розчином хлориду натрію, поміщають в чашку Петрі і відзначають на чорному тлі наявність специфічних поразок.

Лабораторні тварини. Видова чутливість тварин, їх вік визначають репродуктивну спосіб-ність вірусів. У багатьох випадках тільки новонароджені жи-Вотня чутливі до того чи іншого вірусу (наприклад, миші-сисунці до вірусів Коксакі). Перевага методу культивування облігатних внутрішньоклітинних паразитів в ор-ганизме лабораторних тварин перед іншими полягає в воз-можности виділення тих вірусів, які погано репродуці-ються в культурі клітин або ембріоні. До його недоліків відносяться висока ймовірність контамінації організму по-допитних тварин сторонніми вірусами і мікоплазмами, а також необхідність подальшого зараження культури кле-ток для отримання чистої культури даного вірусу, що збіль-лічівает терміни дослідження.

Методи індикації вірусів. Для демонстрації при-присутність вірусу в клітинній культурі використовують кілька методів.

I. Про розмноження (репродукції) вірусів в культурі клітин судять по цітопаттескому дії (ЦПД), яке може бути виявлено мікроскопічно за морфологічними через трансформаційних змін клітин.

а) Частина таких клітин гине і відшаровується від стінок пробірки. б) Вірусні частинки, що звільняються при руйнуванні одних клітин, інфікують інші, які через деякий час також гинуть. В результаті замість суцільно-ного клітинного моношару залишаються лише окремі клеточ-ні острівці.

Характер ЦПД, викликаного різними вірусами, неоднаковий. При репродукції одних вірусів (Параміксовіру-си, герпесвіруси) спостерігається злиття клітин з утворенням синцития, інших (ентеровіруси, реовіруси) - зморщування і деструкція клітин, третє (аденовіруси) - агрегація клітин. ЦПД вірусів оцінюють в динаміці, переглядаючи культуру клітин під мікроскопом в різні терміни після її зараження вируссодержащим матеріалом. Ні-які віруси (ентеровіруси, герпесвіруси) викликають ЦПД протягом 1-2 діб, інші - в більш пізні терміни (на 4 ^ -6-й день). Характер ЦПД використовують як для виявлення вірусів (індикації), так і орієнтовною ідентифікації, тобто оп-ределенном їх видової приналежності.

Деякі віруси можна виявити і ідентифікувати за включеннями, які вони утворюють в ядрі або цитоплазмі заражених клітин. Форма включень різна, а розміри коливаються від 0,25 до 25 мкм. Вони являють собою місця скупчення вірусних частинок і можуть бути виявлені в препара-тах, приготованих із зараженої тканини і забарвлених флюорохромами. У послід-нього випадку використовують люмінесцентну мікроскопію.

Для дослідження морфології контамінованих клітин використовують спеціальний інвертований мікроскоп, у ко-торого освітлювач розташовується зверху, а об'єктиви - знизу від предметного столика. За допомогою такого приладу можна оцінювати морфологію клітин, що ростуть у вигляді моношару на поверхні контейнера для культивування. Морфологічес-кі зміни клітин виявляють при мікроскопічному ис-проходженні культури за допомогою об'єктива 8х або 40х. При порівнянні клітинного моношару, інфікованого вірусом, з незараженими клітинами в контрольній пробі зазначають повне або острівцевих руйнування пласта клітин або інші зміни, які характеризують ЦПД вірусу. Для більш детального вивчення ЦПД в контейнер для культивування поміщають покривне скло, на якому утворюється моношар. Надалі скло витягають, заражені клітини фіксують-ють і готують мікроскопічний препарат, який фарбуючи-ють флюорохромами і т.д.) і вивчають іммерсійним методом.

ЦПД вірусів можна також продемонструвати за допомогою "кольоровий проби": метаболічно активні клітини культури в ході життєдіяльності виділяють кислі продукти, що ви-викликають зміну кольору індикатора, присутнього в культуральному середовищі. При репродукції вірусу клітини втрачають здатність до метаболізму і гинуть, тому забарвлення середовища з плином часу не змінюється.

II. Реакцію гемадсорбції застосовують для індикації гемаг-глютінірующіх вірусів. Реакція заснована на здатності поверхні клітин, в яких репродукується такі віруси, адсорбувати еритроцити. Для постановки реакції гемад-сорбції в культуру клітин, заражених вірусами, додають суспензію еритроцитів і після деякого часу контакту кліть-ки промивають фізіологічним розчином хлориду натрію. На поверхні уражених вірусами клітин залишаються прилип-шие еритроцити.

III. Реакцію гемаглютинації (РГА) застосовують для обна-ружения гемагглютинирующих вірусів в культуральної рідини зараженої культури клітин або хоріоналлантоісной або амніотичної рідини курячого ембріона. Гемаглютинацію - "склеювання" еритроцитів різних видів тварин (курей, гусей, морських свинок) - викликають віруси, що містять в оболонці гемаглютинін. Для постановки реакції гемагглюті-нації до досліджуваного матеріалу додають суспензію еритроцитів. У присутності вірусів відбувається аглютинація еритроцитів.

3 і т.д. За титр РДА при-ють максимальне розведення, при якому спостерігається гемагглютинация (++). Титр РДА характеризує активність вірусу і використовується при постановці РГГА.

Для кількісного виявлення вірусних частинок ис-товують методи титрування. Титр вірусу можна визначити в реакції гемаглютинації з 10-кратними розведеннями куль-натуральній середовища, або матеріалу з курячого ембріона, або по ЦПД в культурі клітин. В останньому випадку клітини культури заражають 10-кратними розведеннями матеріалу, що містить вірус. Після 6-7-денної інкубації їх переглядають на наявність ЦПД. За титр вірусу приймають найбільше розведення, яке викликає ЦПД в 50% заражених куль-тур. Титр вірусу висловлюють кількістю цитопатичних (інфекційних) доз (ІД5 о)

-Більш точним количествен-ним методом обліку окремих-них вірусних частинок являє-ся метод бляшок. Культуру клітин заражають вірусом і покривають тон-ким шаром агару. Після ін-кубування посівів в тече-ня декількох діб на по-поверхні агару з'являються просвітлені ділянки визна-діленої форми (бляшки), що представляють собою ділянки загиблих клітин в суцільно-ном монослое культури клітин. Кожна бляшка утворюється при розмноженні однієї ві-РУСН частки і добре помітна у вигляді круглого світлого ділянки на червоному тлі клітин, прижиттєво забарвлених нейтральним червоним. Титр вірусу, встановлений цим ме-тодом, висловлюють числом бляшкообразующіх одиниць (БОЮ) в 1 мл. Розміри, морфологія і терміни появи бляшок разли-ються не тільки у різних видів вірусів, але і у окремих штамів одного і того ж виду. Перераховані ознаки використовують для селекції штамів і одержання так називає-мих чистих ліній вірусів.