лр №9

м Херсон, БДАУ, кафедра інфекційних хвороб,

зоогігієни та ветсанекспертизи

Лабораторна робота № 9

Біохімічні властивості мікроорганізмів

Мета заняття. Вивчити біохімічну диференціацію мікроорганізмів. Встановити відмінність між ешеріхіями і сальмонелами на середовищах з вуглеводами і багатоатомних спиртами (кольоровий ряд, середа Ендо). Провести хімічне і мікроскопічне дослідження культури і вивчити основних представників процесу аммонификации.

Устаткування і матеріали: культури аммоніфіцірующіх мікроорганізмів на МПБ, МПА і МТЖ (Bac.Mycoides, Bac.Mesentericus, Bac.Subtilis, фуксин Пфейффера, предметні і покривні скла, мікроскопи, пальники, сірники, посіви культурE.Colli, S.dublinна МПБ і МПА, а також на середовищах з вуглеводами і багатоатомних спиртами (лактоза, сахароза, глюкоза, маніт, дульцит і ін.), посів цих культур на середовищі Ендо в чашках Петрі, кедрова олія. Таблиці: біохімічна диференціація ентеробактерій - мікробів кишково-сальмонеллезной групи , аммоніфіцірующіе мікроорганізми.

Життєві процеси мікроорганізмів тісно пов'язані з діяльністю ферментів. Кожному виду мікробів властиві певні ферменти, що дозволяє диференціювати їх з урахуванням інших ознак і властивостей.

До біохімічної диференціації вдаються зазвичай в тому випадку, якщо мікроорганізми мають багато спільних ознак: важко помітний ріст на живильних середовищах, клітини, морфологічно схожі один на одного, і т. Д. Така схожість спостерігається серед ешерихій і сальмонел. При їх диференціації крім зброджування цукрів враховують здатність згортати молоко, утворювати гази і інші властивості. У молоці міститься лактоза, яку зброжує кишкова паличка. В результаті утворюється кислота, яка обумовить згортання продукту. При висіві на молоко збудника сальмонельозу кислота не продукується.

Біохімічні властивості - здатність мікроорганізмів під дією своїх ферментів розщеплювати органічні сполуки.

Розрізняють сахаролитические, протеолітичні і гемолітичні властивості.

Сахаролитические властивості мікроорганізмів - здатність мікроорганізмів під дією своїх ферментів розщеплювати цукру (вуглеводи).

Ферменти, що утворюються мікробами, мають здатність розщеплювати цукор (вуглеводи і багатоатомні спирти) на альдегіди і кислоти. Кінцеві продукти ферментації - діоксид вуглецю (СО2) і водень. Різні ферменти неоднаково реагують з одними і тими ж цукрами. Це їх властивість використовується при біохімічній диференціації мікроорганізмів.

Сахаролитические властивості мікробів вивчають в рідких, щільних і напіврідких поживних середовищах.

Сахаролитические властивості в рідких поживних середовищах. Виявляють на середовищах Гісса (середовища з цукрами), які представляють собою суміш цукру і індикатора в пептонній воді. З цукрів використовують лактозу, глюкозу, маніт, мальтозу, сахарозу, арабинозу, дульцит і ін. В якості індикаторів застосовують нейтральний червоний лакмус, фуксин основний і т. Д. Середовища можуть бути рідкими, тоді для уловлювання газу на дно пробірки опускають маленькі пробірки Уленгута «газовка» перевернуті (спрямовані) закритим кінцем вгору. Утворився в процесі ферментації газ витісняє частину середовища і накопичується у верхній частині «газовка».

Сахаролитические властивості в напіврідких поживних середовищах з вуглеводами і індикатором ВР (суміш водного блакитного і розоловой кислоти) можуть спостерігатися розрив стовпчика агару і скупчення дрібних бульбашок в товщі середовища і на її поверхні, а також зміна кольору. При нейтральній реакції індикатор не змінюється (безбарвний), в кислому середовищі він приймає синій колір, в лужному - червоний. У такій же колір забарвлюється і агар. Чисті культури висівають на такі середовища і витримують в термостаті при певній температурі (для патогенних - 37 0 С, для сапрофитов - 25-30 0 С).

Сахаролитические властивості на щільних поживних середовищах. Біохімічну диференціацію здійснюють і на середовищі Ендо. Агар Ендо містить вуглевод лактозу і індикатор знебарвлений фуксин, який у лужному середовищі безбарвний, а в кислому середовищі відновлює свій колір (червоніє).

При зброджуванні мікробами лактози утворюється кислота, відновлюється фуксин, який забарвлює колонії в червоний колір. Кишкова паличка (ешерихій) розщеплює лактозу і середовище окислюється. У кислому середовищі відновлюється фуксин і колонії кишкової палички на середовищі Ендо фарбуються в цегляно-червоний колір з металевим відтінком. Колір колоній сальмонельозних бактерій не змінюється, так як вони не зброджують лактозу.

Протеолітичні властивості мікробів - здатність мікроорганізмів під дією своїх ферментів розщеплювати білки (протеїн). Білки розщеплюються мікроорганізмами з утворенням газоподібних продуктів: аміаку, сірководню та індолу.

Визначення аміаку. Аміак (продукт гнильного розпаду білків) виявляють по зміні рожевої лакмусового паперу, яка в присутності цієї речовини синіє. У пробірку з посівом, між стінкою і пробкою пробірки, закріплюють над культурою рожеву лакмусовий папір, яка при наявності аміаку вступає у взаємодію з її парами і утворюється луг, лакмусовий папір синіє. За посиніння лакмусового паперу судять про наявність аміаку.

Визначення сірководню. Сірководень (кінцевий продукт сірковмісних амінокислот - цистину, цистеїну, метіоніну) можна виявити за допомогою смужки фільтрувального паперу розміром 1 см х 15 см, обробленої 5% -ним водним розчином оцтовокислого свинцю і підвішеною над культурою досліджуваних мікробів. При вмісті сірководню папір чорніє, який перетворює оцтовокислий свинець в сірчанокислий. Сірководень на білкових середовищах утворює амоніфікаторів і інші організми. За почорніння фільтрувального паперу судять про наявність сірководню.

Визначення індолу. Індол (продукт перетворення амінокислоти триптофану) виявляють на середовищі без вуглеводів, особливо глюкози, яка перешкоджає його утворенню. Індолообразованіе - одна з ознак при визначенні виду мікробів, тому його використовують при їх диференціації. Існує кілька методів визначення індолу (Ерліха, Сальківського, Строгова і ін.), Але найбільш простий і доступний з них - метод Мореллі: визначення проводять за допомогою смужки фільтрувального паперу, змоченою гарячим насиченим 12% -ним водним розчином щавлевої кислоти і висушеної в термостаті . Папір підвішують так само, як і при визначенні продуктів аммонификации. Культуру вирощують три доби в термостаті, потім визначають результати взаємодії продуктів життєдіяльності мікробів і щавлевої кислоти. Порозовеніе нижній частині індикаторного паперу вказує на наявність індолу.

Визначення каталази. Фермент каталаза розкладає пероксид водню на кисень і воду. Для її визначення на предметне скло наносять краплю 2-3% розчину пероксиду водню і така ж кількість мікробної культури. При наявності у даного виду мікробів каталази виділяються бульбашки газу (кисень).

Гемолітичні властивості мікробів - здатність мікроорганізмів під дією своїх ферментів розщеплювати гемоглобін.

Деякі види бактерій в процесі життєдіяльності виробляють особливі речовини, що володіють лізуючого (розчиняє) дією на еритроцити. Ці речовини білкової природи називаються гемотоксини. Для визначення гемолітичної здатності проводять посів на поживні середовища, що містять 5% дефібринованої крові (частіше використовують кров'яний МПА). При зростанні на кров'яний середовищі мікроорганізмів, що володіють гемолітичними властивостями, навколо колоній в результаті лізису еритроцитів утворюється прозора зона (безбарвна або пофарбована). У рідких поживних середовищах при гемолізі середовище стає прозорою (червоно-лакова кров).

1 Ознайомитися з тестами, що характеризують ферментативні властивості бактерій (ферментація вуглеводів в середовищах Гісса, освіта індолу, сірководню; тести на каталазу).

2 Використовуючи картки з описом властивостей бактеріальної культури, за допомогою визначника мікробів встановити її видову пріпрінадлежность.

Питання для самоконтролю знань

1 Методи визначення сахаролитических властивостей мікроорганізмів.

2 Методи визначення протеолітичних властивостей мікроорганізмів.

3 Методи визначення індолу, сірководню, аміаку.

4 Визначення гемолітичних властивостей мікроорганізмів.