іммобілізовані ферменти
Одне із завдань інженерної ензимології полягає в розробці технології отримання і використання іммобілізованих ферментів. Іммобілізованими ферментами називаються ферменти, штучно пов'язані з нерозчинним носієм, але зберігають свої каталітичні властивості. Початок цьому напрямку біотехнології було покладено в 1916 році, коли Дж.Нельсон і Е.Гріффін адсорбувати на вугіллі инвертазу і показали, що вона зберігає в такому вигляді каталітичну активність.
В даний час в поняття «іммобілізація» вкладають ширший сенс - повне або часткове обмеження свободи руху білкових молекул.
Іммобілізовані ферменти мають ряд переваг в порівнянні з вільними молекулами:
· Представляють собою гетерогенні каталізатори, легко відокремлюються від реакційного середовища, що дає можливість зупинити реакцію в будь-який момент, використовувати фермент повторно, а також отримувати чистий від ферменту продукт;
· Можуть використовуватися багаторазово і забезпечують безперервність каталітичного процесу;
· Змінюють свої властивості: субстратне специфічність, стійкість, залежність активності від параметрів середовища;
· Довговічні в тисячі і десятки тисяч разів стабільніше вільних ензимів.
Все перераховане забезпечує високу економічність, ефективність і конкурентоспроможність технологій, які використовують іммобілізовані ферменти.
Иммобилизовать ферменти можна як шляхом зв'язування на нерозчинних носіях, так і шляхом внутрішньомолекулярної або міжмолекулярної зшивання білкових молекул низькомолекулярними біфункціонального сполуками, а також шляхом приєднання до розчинного полімеру.
Носії для іммобілізації ферментів. До носіїв ставляться такі вимоги:
· Висока хімічна та біологічна стійкість;
· Висока хімічна міцність;
· Достатня проникність для ферменту і субстратів, пористість, велика питома поверхня;
· Можливість отримання у вигляді зручних в технологічному відношенні форм (гранул, мембран);
Для отримання іммобілізованих ферментів використовується обмежене число як органічних, так і неорганічних носіїв (рис. 7.1).
Мал. 7.1. Класифікація носіїв для іммобілізованих ферментів
Органічні полімерні носії. Існуючі органічні полімерні носії можна розділити на два класи: природні (білкові, полісахаридні і ліпідні) і синтетичні полімерні носії (поліметіленовимі, поліамідні і поліефірні).
Переваги природних носіїв. доступність, поліфункціональність і гідрофільність; недоліки: біодеградіруемие і високу вартість.
З полісахаридів для іммобілізації найбільш часто використовують целюлозу, декстран, агарозу і їх похідні. Для додання хімічної стійкості лінійні ланцюга целюлози і декстрану поперечно зшивають епіхлоргідрином. В отримані сітчасті структури вводять різні іоногенні угруповання. Хімічною модифікацією крохмалю зшиваючими агентами (формальдегід, гліоксаль, глутаровий альдегід) синтезований новий носій - губчастий крохмаль, що володіє підвищеною стійкістю до глікозідази.
З природних аміносахаридом в якості носіїв застосовують хітин. Хітин хімічно стійок і має добре виражену пористу структуру.
Серед білків в якості носіїв застосовують структурні протеїни, - кератин, фиброин, колаген і желатину (продукт переробки колагену). Білки здатні до біодеградації, що дуже важливо при конструюванні іммобілізованих ферментів для медичних цілей. До недоліків білків як носіїв в цьому випадку слід віднести їх високу імуногенність.
Синтетичні полімерні носії. Більшість синтетичних полімерних носіїв володіють механічною міцністю, і можливістю варіювання в широких межах величини пір. Деякі синтетичні полімери можуть бути зроблені в різних фізичних формах (труби, волокна, гранули). До них відносяться полімери на основі стиролу, акрилової кислоти, полівінілового спирту; поліамідні і поліуретанові полімери.
Носії неорганічної природи. В якості носіїв найчастіше застосовують матеріали зі скла, глини, кераміки, графітової сажі, силікагелю, а також сілохроми, оксиди металів. Їх можна піддавати хімічній модифікації, для чого носії покривають плівкою оксидів алюмінію, титану, цирконію або обробляють органічними полімерами. Основна перевага неорганічних носіїв - легкість регенерації. Подібно синтетичних полімерів неорганічним носіям можна надати будь-яку форму і отримувати їх з будь-яким ступенем пористості.
Методи іммобілізації ферментів
Існують два принципово різних методу іммобілізації ферментів: фізичні (без виникнення ковалентних зв'язків між ферментом і носієм) і хімічні (з утворенням ковалентного зв'язку між ними) (рис. 7.2).
Рис 7.2. Методи іммобілізації ферментів Фізичні методи іммобілізації: а - адсорбція; б - включення в гель; в - инкапсулирование; г - включення в ліпосоми; Хімічні методи іммобілізації: д - ковалентні зв'язування
Фізичні методи іммобілазаціі є включення ферменту в таке середовище, в якій для нього доступною є лише обмежена частина загального обсягу. При фізичної іммобілізації фермент не пов'язаний з носієм ковалентними зв'язками. Існує чотири типи зв'язування ферментів.
Адсорбція ферментів на нерозчинних носіях. Адсорбція була першим методом іммобілізації ферментів і стала найбільш широко поширеним способом отримання іммобілізованих ферментів в промисловості. Як адсорбенти використовують кремнезем, активоване вугілля, графітовий сажа, різні глини, пористе скло, полісахариди, синтетичні полімери, оксиди алюмінію, титану та інших металів. При адсорбційної іммобілізації білкова молекула утримується на поверхні носія за рахунок електростатичних, гідрофобних, дисперсійних взаємодій і водневих зв'язків. Ефективність адсорбції визначається питомою поверхнею (щільністю центрів сорбції) і пористістю носія.
Процес адсорбції ферментів на нерозчинних носіях відрізняється простотою і досягається при контакті водного розчину ферменту з носієм (статистичним способом, при перемішуванні, динамічним способом з використанням колонок). З цією метою розчин ферменту змішують зі свіжим осадом, наприклад, гідроксиду титану, і висушують в м'яких умовах. Активність ферменту при такому варіанті іммобілізації зберігається практично на 100%, а питома концентрація білка досягає 64 мг на 1 г носія.
До недоліків адсорбционного методу відноситься невисока міцність зв'язування ферменту з носієм (при зміні умов іммобілізації можуть відбуватися десорбція ферменту, його втрата і забруднення продуктів реакції). Міцність зв'язування ферменту з носієм може підвищити попередня модифікація носія (обробка іонами металів, поліфункціональними агентами - полімерами, білками, гідрофобними сполуками, монослоем липида та ін.). Іноді, модифікації піддається молекула вихідного ферменту, однак найчастіше це веде до зниження його активності.
Іммобілізація ферментів шляхом включення в гель. Спосіб іммобілізації ферментів шляхом включення в тривимірну структуру полімерного гелю широко поширений завдяки своїй простоті і унікальності. Метод застосуємо для іммобілізації не тільки індивідуальних ферментів, а й мул'тіензімних комплексів і навіть інтактних клітин. Іммобілізацію ферментів в гелі здійснюють двома способами:
· Фермент вводять в водний розчин мономера, а потім проводять полімеризацію, в результаті якої виникає просторова структура полімерного гелю з включеними в його осередку молекулами ферменту; використовують гелі поліакриламіду, полівінілового спирту, полівінілпіролідону, силікагелю;
· Фермент вносять в розчин вже готового полімеру, який згодом переводять в гелевидний стан; використовують гелі крохмалю, агар-агар, каррагинана, агарози, фосфату кальцію.
До переваг іммобілізація ферментів в гелях відносять:
· Рівномірний розподіл ензиму в обсязі носія;
· Висока механічна, хімічна, теплова та біологічна стійкість матриці;
· Можливість багаторазового використання ферменту, включеного в його структуру.
Однак метод непридатний для іммобілізації ферментів, що діють на водонерозчинні субстрати.
Іммобілізація ферментів в напівпроникні структури. Сутність цього способу іммобілізації - відділенні водного розчину ферменту від водного розчину субстрату за допомогою напівпроникною мембрани, що пропускає низькомолекулярні молекули субстратів і кофакторів, але затримує великі молекули ферменту.
Найбільшого поширення набули дві модифікації цього методу - микрокапсулирование і включення ферментів в ліпосоми.
Мікрокапсулювання полягає в тому, що водний розчин ферменту включається всередину замкнутої мікрокапсули, стінки якої утворені напівпроникну полімером.
Розмір одержуваних капсул становить десятки або сотні мікрометрів, а товщина мембрани - соті частки мікрометра.
Переваги методу микрокапсулирование:
· Можливість багаторазового використання нативного ферменту (фермент може бути відділений від непрореагировавшего субстрату і продуктів реакції процедурою простого фільтрування);
· Можливість иммобилизовать не тільки індивідуальні ферменти, але і мультиензимних комплекси, цілі клітини і окремі фрагменти клітин.
До недоліків методу слід віднести неможливість інкапсульованих ферментів здійснювати перетворення високомолекулярних субстратів.
Включення водних розчинів ферментів в ліпосоми. Для отримання ліпосом з розчинів ліпіду (найчастіше лецитину) упаривают органічний розчинник. Частину, що залишилася тонку плівку ліпідів диспергируют у водному розчині, що містить фермент. В процесі диспергування відбувається самосборка біслойних ліпідних структур ліпосоми, що містять включений розчин ферменту.
Ферменти, іммобілізовані шляхом включення в структуру ліпосом, використовують переважно в медичних і наукових цілях. Вивчення ліпосом має велике значення для розуміння закономірностей процесів життєдіяльності клітини, оскільки значна частина ферментів в клітці локалізована в складі ліпідного матриксу біологічних мембран.
Хімічні методи іммобілізації ферментів. Іммобілізація ферментів шляхом утворення нових ковалентних зв'язків між ферментом і носієм - найбільш масовий спосіб опромінення промислових біокаталізаторів.
На відміну від фізичних методів цей спосіб іммобілізації забезпечує міцну і необоротну зв'язок ферменту з носієм і часто супроводжується стабілізацією молекули ензиму. Однак розташування ферменту щодо носія на відстані однієї ковалентного зв'язку створює труднощі в здійсненні каталітичного процесу. Фермент відокремлюють від носія за допомогою вставки (зшивання, спейсер), в ролі якої найчастіше виступають біфункціональні і поліфункціональні агенти (бромціан, гідразин, сульфурілхлорід, глутаровий діальдегід і ін.).
Принципово важливо, щоб в іммобілізації ферменту брали участь функціональні групи, які не є важливими для його каталітичної функції. Так, глікопротеїни зазвичай приєднують до носія через вуглеводну, а не через білкову частину молекули ферменту.
Всі методи хімічної іммобілізації класифікують в залежності від природи реакційної групи носія, яка вступає у взаємодію з молекулою ферменту.
Іммобілізація ферментів на носіях, що володіють гидроксогруппами. Найбільш поширеним методом утворення ковалентного зв'язку між ферментом і полісахаридних носієм або синтетичним діольним з'єднанням є бромціановий метод. При обробці носія бромцианом виникають реакційноздатні ціанати і імідокарбонати, які при взаємодії з нуклеофільними аміногрупами ферменту утворюють похідні ізомочевіни і уретанів:
Іммобілізація ферментів на носіях, що володіють аминогруппами. Первинні аміногрупи носія, пов'язані з ароматичним кільцем, попередньо перетворюють на солі діазонію, які потім піддають різноманітним реакцій поєднання. В реакції поєднання вступають фенольні, імідазольного, амінниє, гуанідинового, тіольньте групи білків.
Іммобілізація на носіях, які мають активованими похідними карбоксильної групи. Найбільш часто для з'єднання аминогрупп білка з ацильними угрупованнями носія використовують ангідриди, галогенангідриди, активовані ефіри та інші похідні карбонових кислот.
Іммобілізація на носіях, що володіють сульфгідрильними групами. Сульфгідрильні групи носія і ферменту легко окислюються з утворенням дисульфідних зв'язків під дією кисню повітря:
Переваги хімічної іммобілізації - висока ефективність і міцність зв'язку. Однак, методи ковалентного іммобілізації малодоступні для промислового використання в зв'язку зі складністю і дорожнечею їх застосування.