Визначення протеолітичної активності молокозсідальної препаратів
Молокозсідальної препарати, крім молокозсідальної активності, мають і протеолітичної активністю, тобто здатність розщеплювати білки молока.
У зв'язку з гострим дефіцитом в сироробний промисловості натурального химозина (сичужний фермент) все більше застосування знаходять його замінники мікробного і тваринного походження. Однак не всі препарати можуть успішно замінювати сичужний фермент. Препарати, які мають високу протеолітичну активність, викликають глибокий гідроліз казеїну, що призводить до різкого зниження якості сиру (появі гіркоти). У зв'язку з цим при визначенні придатності будь-якого препарату в якості замінника сичужного ферменту необхідно досліджувати його протеолітичну активність.
Особливістю дії зазначеного препарату на казеиновую молекулу є виборча атака їм зв'язку фенілаланіл-метіонін до -казеіна, що в свою чергу призводить до відкриття залишків фосфорної кислоти і об'єднанню молекул параказеіна в згусток за допомогою освіти Са-містків. Схематично це можна висловити таким чином (рисунок 7):
Далі молекула казеїну практично не гідролізується, що забезпечує стійкість згустку і, далі, сирного зерна. Графічно це зображено на малюнку 8.
В даному випадку підйом кривої протягом 15 хвилин (крива 1) відображає освіту ГМП. Надалі гідроліз практично відсутня. Відхилення від цього (крива 2) як правило призводить до порушень в освіті згустку і дозрівання сирів. Відстань між кривими 1 і 2 називається мірою неспецифічного протеолізу (МНП). Чим більше ця величина, тим більша небезпека появи гіркого, нечистого і інших присмаків в готовому продукті.
Малюнок 7 - Схема дії сичужного ферменту на молекулу казеїну
Малюнок 8 - Графік залежності утворення продуктів гідролізу казеїну від часу реакції
У даній роботі ставиться завдання визначити придатність випробуваного препарату в якості замінника сичужного ферменту виходячи з інтенсивності гідролізу казеїну в часі.
Принцип методу. Визначення активності сичужного ферменту і його замінників мікробного і тваринного походження засноване на обліку накопичення продуктів гідролізу казеїну, розчинних в 1,125 М трихлоруксусной кислоті через певний проміжок часу від початку реакції.
Хід роботи. У пробірки відбирають по 2 мл приготованого казеїнового субстрату і термостатируют 5 хв. при температурі 35 ° С. Потім вносять по 0,5 мл розчину ферментного препарату з одночасною фіксацією часу. Реакцію припиняють через 5, 10, 15, 20, 30, 40, 90 хвилин шляхом додавання 5 мл 1,125 М розчину ТХУ. Отриману суміш перемішують і залишають на 30 хвилин, після чого її фільтрують через подвійний складчастий фільтр. Паралельно з зазначеною ухвалою ставляться нульова і неодружена проби.
Для нульового значення в пробірку відбирають 2 мл розчину субстрату, 5 мл 1,125 М розчину ТХУ і 0,5 мл розчину ферментного препарату.
Результат холостого досвіду виключає екстінціі реактивів. Для цього до 5 мл 1.125 М розчину ТХУ додають 2,5 мл дистильованої води і фільтрують так само, як і в разі нульового досвіду через 30 хвилин. У фільтраті визначають продукти гідролізу казеїну, розчинні в 0,75 М розчині ТХУ. Певна кількість фільтрату (не більше 1 мл) відбирають у пробірки з таким розрахунком, щоб концентрація отриманих продуктів розпаду казеїну під час колориметрування перебувала в межах від 20 до 150, нейтралізують рівною кількістю 0,75 М розчину NaOH (з метою забезпечення необхідного значення рН для реакції з мідним і фенольним реагентами), додають дистильовану воду до об'єму 2 мл, а потім всі необхідні реактиви, передбачені методом Лоурі. Після 45-хвилинної експозиції заміряють екстінціі при 750 нм по відношенню до значення холостого досвіду.
Для побудови калібрувальної кривої (20 - 200) служить казеїн по Гамммарстену (див. Методичні вказівки до виконання УИРС по біохімії для студентів спец. 1017, роботу № 5 "Визначення білка в молоці за методом Лоурі"). Передбачається, що продукти розпаду казеїну дають ті ж екстінціі, що і незмінний казеїн.
Досвід проробляють тричі.
Розрахунок отриманих даних
Протеолітичнаактивність показиват, яка кількість мг білка казеїну перекладається в розчинну форму одним міліграмом ферментного препарату при 35 ° С, рН 6,6, за певний проміжок часу. Розрахунок протеолітичної активності (Ер) проводиться за такою формулою:
де: Ер - протеолітична активність ферментного препарату;
С - концентрація ферментного препарату, мг;
А - кількість розчинних продуктів гідролізу казеїну за певний проміжок часу, мг
де: В - кількість продуктів гідролізу казеїну в відповідне виміряної екстинкції;
7,5 - обсяг проби (2 мл субстрату, 0,5 мл ферментного препарату, 5 мл розчину ТХУ);
V - об'єм розчину, взятого для колориметрування, мл.
Матеріали і реактиви. Казеїн (див. Додаток 1, п.7); реактив А, В, С (див. Додаток 1, п.17); реактив Фолина (див. Додаток 1, п. 8); ферментні препарати; 1,125 М розчин ТХУ; 0,75 М розчин їдкого натру.
Устаткування. Складчастий фільтр; пробірки; піпетки на 1 і 2 мл з ціною поділки 0,05 мл; ФЕК-60 або ФЕК-56М.