Що таке вестерн блот аналіз, опис методу вестерн блот (western blotting) - bialexa
Що таке вестерн-блот?
Ідентифікація білка в складних сумішах або екстрактах різних тканин є однією з найпоширеніших завдань. Використовуючи такий інструмент як специфічні антитіла, можна визначити досліджуваний білок з мінімумом тимчасових і фінансових витрат.
У методі Вестерн-блот (Western blotting) на першому етапі суміш білків розділяється методом електрофорезу в присутності додецилсульфату натрію (ДСН), потім переноситься на нітроцелюлозну мембрану методом електроблоттінга. Суть даного методу полягає в тому, що гель після електрофорезу поміщається на нітроцелюлозну мембрану між шарами фільтрувального паперу. Зібраний таким чином «сендвіч» поміщається в електричне поле так, що комплекси білок-ДСН рухаються поперек пластини гелю і мобілізують (в результаті неспецифічної сорбції) на поверхні нітроцелюлозній мембрани.
У зв'язуванні комплексу білок-ДСН з нітроцелюлозній мембраною беруть участь в основному сили електричної природи, причому дана взаємодія є многоточечним і призводить до «распластиваніе» білків на поверхні мембрани. Таким чином, після електропереносу ми отримуємо на нітроцелюлозі репліку гелю з білками, розташованими так само, як і в поліакриламідному гелі.
Після проведення ДСН - електрофорезу, електропереносу і сорбції білків з гелю на нітроцелюлозну мембрану третинна конформація білка сильно змінена, якщо взагалі правильно говорити про існування третинної структури для білка після такої жорсткої обробки. Тому для імуннохімічної детекції досліджуваного білка зазвичай використовуються тільки моно- або поліклональні антитіла, специфічні до лінійним ділянкам білкової молекули. Антитіла, специфічні до конформаційних епітопів (або ділянок, що включає в себе межсуб'едінічние контакти), як правило, не придатні для використання в методі Вестерн-блот.
Після перенесення білків мембрану инкубируют послідовно з антитілами, специфічними до досліджуваного білку, а потім з вторинними антитілами, специфічними до Fc-фрагментами первинних антитіл, кон'югованими з ферментної (або будь-якої іншої) міткою (рис. 1 А). У разі, коли з міткою кон'юговані безпосередньо первинні, специфічні до досліджуваного антигену антитіла, вторинні антитіла не потрібні (рис. 1 Б). Утворилися в місці локалізації досліджуваного білка імунні комплекси «проявляються» за допомогою хромогенного субстрату (залежить від типу мітки).
Чутливість і специфічність методу сильно залежать від того, які антитіла використовуються при проведенні досліджень. Використовувані антитіла повинні бути специфічні до унікальної, характерною тільки для досліджуваного білка послідовності амінокислот. В іншому випадку можлива взаємодія (особливо в разі грубих білкових екстрактів) антитіл з декількома білковими молекулами, що в свою чергу призведе до появи на мембрані декількох забарвлених смуг. Ідентифікація досліджуваного білка в такому випадку часто буває скрутній або взагалі неможливою.
Другим важливим фактором, про який слід пам'ятати при виборі антитіл, є афінітет. Чим вище афінітет використовуваних антитіл, тим яскравіше і чіткіше фарбуються білкові смуги, тим вище чутливість методу. При використанні високоаффінних антитіл можна досягти чутливості 1 нг і навіть вище.
Для візуалізації результату взаємодії пов'язаного з мембраною антигену і антитіл використовують вторинні антитіла, кон'юговані з агентами, здатними в певних умовах давати певний сигнал. Зазвичай в якості такого агента використовують фермент (пероксидазу або фосфатазу), продукт реакції якого має забарвлення і випадає на мембрані у вигляді нерозчинного осаду. Також в даному методі можливе використання флуоресцентних міток.
Мал. 1. Схема імунохімічного фарбування досліджуваного білка: А - з використанням вторинних антитіл, кон'югованих з ферментної міткою; Б - первинне антитіло безпосередньо кон'югованими з ферментної міткою.
I. Підготовка гелю і мембрани і електропереносу білків
Поліакріламідний гель після проведення електрофорезу поміщають в ванночку з буфером для блоттинга (25 мМ Тріс, рН 8,3, 192 мМ гліцин, 10% етанол). Два листа фільтрувального паперу, вирізані по формі касети для блоттинга і змочені буфером для блоттинга, поміщають на ту частину касети, яка буде звернена до анода. Потім на фільтрувальну папір поміщають попередньо змочену тим же буфером нітроцелюлозну мембрану, стежачи за тим, щоб між мембраною і папером не було бульбашок повітря. Після цього на мембрану слід обережно помістити гель, знову звернувши особливу увагу на відсутність бульбашок повітря між гелем і мембраною. Завершують формування сендвіча два шари змоченою фільтрувального паперу, які поміщаються на поверхню гелю (Рис. 2). Отриманий сендвіч затискається в касеті і поміщається між електродами так, щоб мембрана була звернена до анода.
Мал. 2. Схема електропереносу білків на мембрану.
II. електропереносу
Електропереносу білків на нітроцелюлозну мембрану проводять в буфері, що містить 25 мМ Тріс, рН 8,3, 192 мМ гліцин, 10% етанол протягом 30-50 хв при постійній напрузі 100 В. Час електропереносу залежить від розміру переносяться білків, чим більше білок, тим довше здійснюється електропереносу. Якість електропереносу і розташування білкових смуг оцінюють, фарбуючи нітроцелюлозну мембрану 0,3% розчином Ponceau S в 1% оцтової кислоти. Перед проведенням імунохімічного фарбування мембрану слід промити кілька разів слабо лужним водним розчином Тріс для видалення зв'язався з білками барвника.
III. Імунохімічної фарбування білків, іммобілізованих на нітроцелюлозній мембрані
Для блокування місць неспецифічного зв'язування антитіл мембрану інкубують при постійному перемішуванні при кімнатній температурі протягом 30 хв в PBST (для кращої блокування можна використовувати розчин PBST, що містить 10% сухе знежирене молоко). Після блокування мембрану інкубували протягом години при кімнатній температурі і постійному перемішуванні в PBST, що містить 1-10 мкг / мл специфічних антитіл. Оптимальна концентрація антитіл підбирається емпірично і залежить від афінності взаємодії антитіл з антигеном. Після закінчення інкубації мембрану промити 5 разів PBST і перенести в розчин вторинних антитіл, кон'югованих з пероксидазою хрону. Розведення кон'югату зазвичай вказується виробником на упаковці, або підбирається дослідником емпірично. У розчині вторинних антитіл мембрану інкубувати 1 годину при постійному перемішуванні.
Після ретельної відмивання (мінімум 5 - 6 разів міняти буфер) PBST мембрану переносять в розчин хромогенного субстрату, що містить 3 мг діамінобензідіна (ДАБ) і 10 мкл 30% перекису водню в 10 мл 0.1 М трис-HCl, рН 7,6. Інкубацію проводять при перемішуванні 5 - 10 хвилин. Мембрану після закінчення інкубації з субстратом слід промити PBST, підсушити, промокнув фільтрувальної папером, і відразу ж зробити електронну копію, скануючи в кольорі. Якщо мембрана повністю висихає, прокрашенние білкові смуги бліднуть, і зображення виходить менш яскравим і контрастним.
Примітка: ДАБ є токсичною речовиною і потенційним канцерогеном. Працювати тільки в гумових рукавичках!