Що таке crispr

Що таке CRISPR / Cas9 і як ця технологія змінить медицину

Що конкретно сталося?

Британське державне агентство HFEA (Human Fertilisation and Embryology Authority - Управління по ембріології і штучного запліднення) дозволило проводити генетичну модифікацію людських ембріонів за допомогою технології CRISPR / Cas9. Досі подібні дослідження в Сполученому Королівстві і на Заході взагалі були заборонені. Раніше, близько року тому. перші експерименти були проведені в Китаї, але їх легальний статус був неясний і вони викликали потік критики з боку дослідників. Великобританія ж стане першою із західних країн, офіційно дозволили застосування технології редагування генома по відношенню до людських ембріонів.

Варто відзначити, що дозвіл стосується тільки дослідних цілей. Видано воно поки єдиному науковому колективу - групі, яку очолює Кеті Нікен (Kathy Niakan) з Інституту Френсіса Кріка. Вчені будуть зобов'язані знищити отримані ГМ-ембріони протягом 14 днів після їх отримання. І, звичайно, їх не можна буде підсаджувати жінці для виношування.

І що ж тоді в цьому сенсаційного?

Старт досліджень у Великій Британії - це важливий крок для початку застосування технології редагування генома на людях. Потенційно, технологія CRISPR / Cas9 здатна змінити ставлення людства до сотням і тисячам спадкових захворювань. Якщо раніше вони були або повністю не виліковуються, або допускали паліативне, симптоматичне лікування, то зараз відкривається можливість їх лікувати «по-справжньому», тобто усувати саму причину виникнення хвороби.

Одночасно з появою технології редагування генома з'являється і можливість його «поліпшення», в самих різних сенсах. Поки мова йде про досить простих (з точки зору механізму успадкування) захворюваннях, але потенційно мішенями для редагування можуть стати не тільки «поламані» гени, але і гени просто пов'язані з підвищеним ризиком для здоров'я. Або навіть гени, що відповідають за нешкідливі фізіологічні особливості начебто здатності пити молоко в дорослому віці або успіхи в спорті.

Ця технологія дозволить лікувати рак?

Можливо, але не відразу. Те, що називається в побуті «раком» - це гігантське сімейство різних хвороб з різними механізмами виникнення. Існують різновиди раку, ймовірність виникнення яких тісно пов'язана з особливо «невдалими» варіантами деяких генів. Типовий приклад - ген BRCA1. мутації в якому можуть підвищувати ймовірність виникнення раку грудей в кілька разів. Потенційно, за допомогою технології CRISPR / Cas9 можна внести зміни в геном сперматозоїда чи яйцеклітини і таким чином запобігти передачі мутантного варіанта гена своїм дітям.

Проблема в тому, що для більшості онкологічних захворювань спадковість не грає великої ролі, а значить, технологія редагування генома буде майже марна. З іншого боку, існують важкі спадкові захворювання, у яких висока успадкованого, але вона настільки складна і заплутана, що не зрозуміло, де і які потрібно вносити зміни в геном, щоб знизити ризик їх виникнення. Типовий приклад - шизофренія, ризик розвитку якої, як вважається, успадковується на 80 відсотків (це показано на однояйцевих близнюків). При цьому молекулярний механізм успадкування шизофренії до самого останнього часу був абсолютно незрозумілий і тільки зараз став прояснюватися.

Якщо говорити про те, що за допомогою CRISPR / Cas9 можна буде лікувати в першу чергу, то це перш за все прості моногенні захворювання на зразок бета-таласемії, муковісцидозу або гемофілії.

Що нового в цій технології, якщо методи створення ГМ-тварин давно відомі?

Отримати ГМО можна різними шляхами, в тому числі і за допомогою системи CRISPR / Cas9. Зараз саме на цю технологію переходить все більше і більше біонженеров. Однак між старими і новими технологіями є одна принципова відмінність: це спрямованість внесення змін. Саме в ній полягає принципова відмінність технології CRISPR / Cas9.

Раніше, щоб домогтися появи нового необхідного якості у організму біоінженери просто вбудовували ДНК-конструкцію в клітини. При цьому місце в геномі, куди ця конструкція потрапить, передбачити було неможливо (за винятком окремих випадків на кшталт пекарських дріжджів). Це призводило до того, що, по-перше, природна версія гена в геномі зберігалася (якщо вона там, звичайно, була) і тільки доповнювалася нової, штучної версією.

Такий метод підходить для отримання якогось нового властивості, наприклад, посиленого вироблення гормону росту у ГМ-лосося або для синтезу вітаміну А в зернах рису. Однак коли мова йде про заміну зламаного гена на його правильну копію, тим більше в людській ДНК, то зрозуміло, що ненаправленим - це великий мінус. Крім того, випадкове вбудовування в геном може призводити до неефективної роботи трансгени - активність будь-якого гена у ядерних організмів залежить від його оточення, від локальної структури хроматину. Тому трансгени, що потрапив в невдалий шматок генома, може виявитися просто-напросто вимкнений або, навпаки, занадто активний. На відміну від старих методів технологія CRISPR / Cas9 дозволяє не просто вмонтувати нову послідовність в ДНК, а замінити її стару версію на нову.

І як це працює?

У два етапи. Спочатку спеціальна нуклеаза (т. Е. Фермент, розрізає ДНК), вносить двуцепочечной розрив в потрібне місце геному. Це місце нуклеаза знаходить за допомогою короткої направляючої РНК (підібраною вченими), чия послідовність повинна з точністю до букви збігатися з потрібною послідовністю в геномі. Після того, як розрив внесений, включаються внутрішні механізми клітини, так звана система репарації.

Потрібно розуміти, що поява двуцепочечной розриву в ДНК - це аварійна ситуація для будь-якої клітини. Розрив веде до появи мутацій і взагалі загрожує цілісності геному. Тому існують спеціальні білки, які знаходять «обірвані кінці» в геномі і запускають реакцію «лагодження». Розрив, звичайно, може бути просто склеєний назад, але це може призвести до втрати кількох «букв» на місці стику і, як наслідок, зрушенням рамки зчитування і повним виключенням гена. Тому клітина зазвичай вважає за краще знайти схожу послідовність поблизу в геномі і використовувати її в якості зразка для відновлення правильної послідовності в місці розриву. Ось тут-то ферментам можна підсунути той варіант ДНК, яким ми хочемо замінити природну послідовність.

Система гомологичной рекомбінації відома з 70-х років минулого століття, що нового привнесла технологія CRISPR / Cas9?

Метод редагування генома CRISPR / Cas9, принаймні в тій формі, що існує зараз, ніяк не впливає на природний механізм рекомбінації - після того, як розрив внесений, заміна ДНК відбувається за рахунок природних механізмів.

Складність з редагуванням генома досі полягала саме в тому, щоб внести цей розрив. Він повинен з'явиться в одному-єдиному місці геному і ніде більше - саме тому, що такі розриви ведуть до появи мутацій. Для порівняння, розмір генома людини складає близько трьох мільярдів нуклеотидів, а напрямна послідовність РНК, яка повинна знайти в геномі своє місце посадки, має в довжину близько двадцяти-сорока нуклеотидів. Дивно, що їй взагалі це вдається. Якщо ж мова йде не про окрему клітці, а про генної терапії цілої тканини, то завдання стає ще складніше - все клітини повинні бути модифіковані, але кожна тільки по одному разу.

До відкриття системи CRISPR / Cas9 вчені вже намагалися розробити методи внесення спрямованих розривів в ДНК. Наприклад, велику роботу в цьому напрямку зробив наш колишній співвітчизник Федір Урнов. Йдеться про раціональне дизайні білків-нуклеаз, які б самостійно (без направляючої РНК) знаходили унікальні послідовності в геномі. Складність з цими методами в тому, що вони вимагають розробки під кожну конкретну задачу свого власного білка, який потім потрібно синтезувати, виділити, протестувати і т. Д. Працювати з універсальної нуклеазами і специфічної спрямовуючої РНК набагато простіше, але вчені не знали про таку можливість , поки не була відкрита система бактеріального імунітету.

І при чому тут бактерії?

За технологією CRISPR / Cas9, яку ми розглядаємо просто як спосіб редагування генома, варто фундаментальне і дуже важливе для сучасної біології відкриття. Воно полягає в тому, що величезна кількість бактерій несуть в своєму геномі (де, здавалося б, все давним-давно зрозуміло) витончену систему адаптивного імунітету проти вірусів. Основа цієї системи це особливі ділянки геному - короткі паліндромний кластерні повтори або CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats).

Повтори виступають в ролі «полиць», між якими в геномі розташовані «досьє» на віруси, з якими колись стикалися предки даної бактерії. «Досьє» - це просто короткі фрагменти ДНК, які збігаються з послідовності з фрагментами геному ДНК вірусів. Якщо вірус з збігається ДНК потрапить в бактеріальну клітину, він досить швидко буде розпізнано спеціальним ферментом, нуклеазами Cas9. Останній для пошуку вірусної ДНК використовує синтезовану з CRISPR РНК-копію.

Якщо який-небудь фрагмент генома вірусу точно збігся з тим, що записано в «досьє», Cas9 розрізає вірусну ДНК і запускає ланцюг реакцій, в результаті якої вся вона знищується. У загальних рисах ця схема нагадує РНК-інтерференції, яка була відкрита у ядерних організмів років на десять раніше, але це (як і все у еукаріот) істотно складніша і менш ефективна система.

Ближче до практики. Коли за допомогою CRISPR / Cas9 лікуватимуть?

Уже лікують, хоча поки тільки лабораторних тварин. На початку цього року з'явилися обнадійливі дані по лікуванню міодистрофії Дюшена у дорослих мишей, причому експерименти були проведені в трьох різних лабораторіях незалежно. Буквально на днях стало відомо про успішне застосування технології для лікування важкого пігментного ретиніт.

Стартап Editas Medicine, тісно пов'язаний з першовідкривачами технології, вже залучив понад 120 мільйонів доларів інвестицій (в тому числі від Google). Ці гроші підуть на створення експериментального лікування амавроза Лебера десятого типу - це спадкова сліпота, пов'язана з пошкодженням одного з генів, необхідних для роботи світлочутливих клітин сітківки. Клінічні (тобто на людях) випробування в Editas Medicine обіцяють почати вже в наступному році.

Чому ж китайська робота з ембріонами викликала скандал і навіщо британці дозволили роботу тільки в дослідницьких цілях? В чому проблема?

Проблема в довгострокові наслідки процедури редагування генома, які зараз важко передбачити. Це звучить як безглуздий алармизм, зазвичай виходить з уст противників ГМО, але насправді тут ситуація принципово інша.

Яка реальна ефективність - питання більш складне, ніж здається, адже вона сильно залежить від типу і природи клітин, в яких проводиться редагування. Те, що добре працює на мишах, може погано працювати на людях. І поки дослідники не стануть працювати з реальними людськими ембріонами і яйцеклітинами про ефективність процедури і рівні випадкових розривів можна буде тільки здогадуватися.

І що тепер буде?

Ефективність заміни послідовності підвищити буде складніше, тому що вона цілком покладається на природні механізми гомологичной рекомбінації, але робота в цьому напрямку ведеться. Однак навіть якщо ефективність залишиться низькою, при відсутності побічних ефектів технологію CRISPR / Cas9 все ж можна буде застосувати для внесення успадкованих змін в зародкову лінію людини. Наприклад, можна взяти у пацієнта клітини сполучної тканини, провести редагування генома і відібрати тільки ті з них, де редагування пройшло без ускладнень. Ці клітини можна використовувати для отримання індукованих стовбурових клітин, з яких можна потім отримати сперматозоїди і використовувати їх в ЕКО. Тут виникають свої складності, але принаймні на тварин ця технологія працює.

Але не все так райдужно на CRISPR-горизонті. Чим ближче реальне клінічне застосування технології, тим сильніше розгорається суперечка про те, хто отримає від неї дохід. За деякими оцінками, вартість виняткового патенту на технологію може досягати багатьох сотень мільйонів доларів (по крайней мере в таких сумах вимірюється обсяг венчурного фінансування CRISPR / Cas9-стартапів). Патентну суперечку навколо CRISPR / Cas9 обіцяє бути голосніше, ніж всі, що коли-небудь відбувалося в сфері інтелектуальної власності на біотехнології.