Реферат культивування вірусів - банк рефератів, творів, доповідей, курсових і дипломних робіт

Для кількісного накопичення вірусів найбільш зручну систему представляють культури клітин. Перші спроби культивування клітин тварин поза організмом відносяться до кінця минулого століття. Ці уривчасті спостереження вказували на можливість збереження життєздатності тканин і клітин в штучних умовах і поклали початок глибоким науковим дослідженням тканинних культур.

Велика заслуга в справі paзработкі методів культивування тканин належить Каррелю Він вперше довів можливість розмноження клітин тварин у штучних умовах і тим самим продемонстрував їх «безсмертність» і схожість з одноклітинними свободноживущими організмами. Значних успіхів в цьому напрямку досягла група дослідників під керівництвом Ерла. Вони перші отримали зростання великого числа клітин на склі і в рідкій перемішуємо суспензії. Поява антибіотиків і успіхи в створенні штучних поживних середовищ відкрили нову еру в розвитку методів тканинних культур.

Тканинні культури давно знайшли застосування для вирішення різних питань біології і медицини. Однак лише успіхи в області вірусології, досягнуті за допомогою тканинних культур, стали потужним стимулом їх розвитку до сучасного рівня.

Культивування вірусів допомагає вирішити ряд теоретично проблем, пов'язаних з вивченням особливостей взаємодії "вірус-клітина". Крім того вирішення цілої низки прикладних задач, пов'язаних з діагностикою та виробництвом препаратів для профілактики вірусних інфекцій неможливо без накопичення віруссодержащего сировини.

ВИДИ КУЛЬТУР КЛІТИН.

Перенесення клітин цілісного організму в умови життя in vitro припиняє існування їх як одного з численних структурних елементів тканини або органу, до складу яких вони раніше входили. При цьому клітини виходять з-під контролю нейро-гуморальних факторів і набувають ряд особливостей, що залежать як від самого факту відторгнення клітин від цих тканин, так і від конкретних умов їх існування in vitro.

Живучи поза організмом клітини або тканини характеризуються цілим комплексом метаболічних, морфологічних і генетичних рис, різко відмінних від властивостей клітин органів і тканин in vivo.

Залежно від методики первинної експлантаціі тканини і техніки її культивування розрізняють кілька видів переживають і зростаючих культур тканин і клітин. Найбільшого поширення мають одношарові, а також суспензійні культури зростаючих клітин. Саме вони складають основу сучасної лабораторної та виробничої вірусологічної практики.

Розрізняють два основних види одношарових клітинних культур: первинні і перещеплюваних.

Терміном «первинна» позначають клітинну культуру, отриману безпосередньо з тканин людини або тварин в ембріональному або постнатальному періоді. Термін життя таких культур обмежений. Після певного часу в них виникають явища неспецифічної дегенерації, що виражається в грануляції і вакуолізація цитоплазми, округлення клітин, втраті зв'язку між клітинами і твердим субстратом, на якому вони вирощувалися. Періодична зміна середовища, зміна складу останньої і інші процедури можуть лише дещо збільшити терміни життя первинної клітинної культури, але не можуть запобігти її кінцевої деструкції і загибелі. Цілком ймовірно, цей процес пов'язаний з природним згасанням метаболічної активності клітин, виведених з-під контролю нейро-гуморальних факторів, що діють в цілісному організмі.

Лише окремі клітини або групи клітин популяції на тлі дегенерації більшої частини клітинного пласта можуть зберегти здатність до зростання і розмноження. Ці клітини, виявивши потенцію нескінченного розмноження in vitro, при багаторазових перевивку дають початок перещеплюваних культурах клітин.

Розрізняють лінії і штами перещеплюваних клітин. Першим терміном позначають перещеплюваних клітини, які характеризуються потенційним безсмертям і, як правило, гетероплоідним кариотипом другим терміном - полуперевіваемие клітини з диплоїдним набором хромосом і обмеженою тривалістю життя in vitro. Поява і тих, і інших клітин пов'язано з процесом відбору в клітинної популяції первинних культур, що є, таким чином, джерелом всіх ліній і штамів перещеплюваних клітин.

Основна перевага ліній перещеплюваних клітин, в порівнянні з будь-якої первинної культурою, полягає в потенції необмеженого розмноження поза організмом і відносній автономності зближує їх з бактеріями і одноклітинними найпростішими.

Здатність перевіваемих клітин до нескінченного розмноження in vitro знаменує собою якісний стрибок, в результаті якого клітини набувають здатність до автономного існування, подібно до мікроорганізмів, що вирощуються на штучних поживних середовищах. Сукупність змін, що призводять до появи у клітин таких особливостей, називають трансформацією, а клітини перещеплюваних тканинних культур - трансформованими.

Удосконалення техніки культивування клітин значно розширило можливості отримання перещеплюваних клітинних ліній з найрізноманітніших тканин тварин і людини. При цьому не було виявлено вікова межа, вище якого тканини втрачали б здатність адаптації до необмеженого росту in vitro, тобто до трансформації.

Іншим джерелом перевіваемих клітинних ліній є злоякісні новоутворення. В цьому випадку трансформація клітин відбувається in vivo в результаті розвитку патологічного процесу, етіологія якого багато в чому залишається ще невідомою.

Не всі злоякісні новоутворення здатні давати початок перещеплюваних клітинним культурам. Так, наприклад, безуспішними були спроби отримати перещеплюваних клітини з ракових пухлин шлунка і молочних залоз людини. Насилу вдається адаптувати до життя in vitro клітини плоскоклітинного раку шкіри і слизових. З іншого боку, порівняно легко виводяться лінії з тканин сарком і злоякісних пухлин нервової системи.

ЖИВИЛЬНІ СЕРЕДОВИЩА.

У будь-клітинній культурі розрізняють клітинну і рідку фази. Рідка фаза забезпечує життєдіяльність клітин культури і являє собою живильні середовища різного складу і властивостей.

Всі середовища за своїм призначенням поділяються на ростові і підтримують. У складі ростових середовищ повинно міститися більше поживних речовин, щоб забезпечити активне розмноження клітин для формування монослоя на поверхні скла або досить високу концентрацію клітинних елементів в суспензії (при отриманні суспензійних культур). Підтримують середовища фактично повинні забезпечувати лише переживання клітин у вже сформованому монослое при розмноженні в клітинах вірусних агентів.

Ростові і підтримують середовища багатокомпонентних. До їх складу можуть входити як природні продукти (амніотичні рідини, сироватки тварин), так і субстрати, отримані в результаті часткової обробки природних продуктів (ембріональні екстракти, гідролізат лактальбумина, гемогідролізат, аминопептид і т. Д.), А також синтетичні хімічно чисті речовини (амінокислоти, вітаміни, солі).

Як приклад живильного середовища, повністю складається з природних компонентів, можна назвати середу Баклі, запропоновану для вирощування клітинних культур з ниркового епітелію мавп. Цієї середи входить коров'яча амніотіче-ська рідина (85%), кінська сироватка (10%) і коров'ячий ембріональний екстракт (5%).

Всі природні продукти малостандартни, їх використання пов'язане з великою небезпекою мікробної та вірусної контамінації клітинних культур. У зв'язку з цим і відбувається поступове витіснення їх синтетичними стандартними сумішами. Найбільше застосування знаходять синтетичному середовищі 199 і середовище Голка. Широко використовуються середовища, що містять строго певні кількості солей, амінокислот і вітамінів.

Незалежно від призначення всі поживні середовища для тканинних культур конструюються на основі будь-якого збалансованого сольового розчину з достатньою буферною ємністю. Найчастіше ними є розчини Хенкса і Ерла. Ці розчини - обов'язковий компонент будь-якої живильного середовища. Невід'ємним компонентом більшості ростових середовищ є сироватка тварин (теляча, бичача, кінська), без наявності 5-10% якої розмноження клітин і формування монослоя не відбувається.

Включення сироватки в той же час перешкоджає створенню ростових середовищ точного хімічного складу, дуже важливих для розвитку фундаментальних досліджень з клітинної фізіології, так як разом з сироваткою (або її дериватами) вводиться цілий комплекс неконтрольованих факторів, що варіюють в залежності від серії сироватки.

У 50-ті роки Ewans і Waymouth були запропоновані бессивороточной середовища точного хімічного складу. Однак ці середовища не забезпечували тих показників проліферативної активності клітин, які обумовлюють середовища з додаванням сироваток. У зв'язку з цим становить інтерес робота Birch і Pirt, які показали, що для забезпечення інтенсивного росту клітин в бессивороточной середовищах визначальним є включення сірчанокислих солей Fe, Zn, Cu, а також МnС12.

У ростові живильні середовища, а так само в буферний розчин для промивання тканин додають антибіотики. Їх вводять в середу безпосередньо перед вживанням з розрахунку 1 мл основного розчину антибіотиків на 500 мл середовища.

Нижче наведено склад і метод приготування однієї з поширених поживних середовищ.