Приготування гістологічних зрізів - практика гістолога
Для отримання гістологічних зрізів застосовують спеціальні мікротомних ножі. розрізняються за формою, довжині і куту перетину леза. За формою вони являють собою складний сталевий клин, у якого ріжучий край має додаткову клиновидную заточку. Довжина ножа може становити від 8 до 50 см.
По конфігурації леза розрізняють три групи мікротомних ножів: А, В і С. У мікротомних ножів, що відносяться до групи А. одна поверхня рівна, а інша увігнута (їх називають плоско-увігнутими з великою кривизною увігнутій поверхні). Ці ножі найчастіше виготовлені з м'якої або щодо м'якої сталі і призначені для різання об'єктів, залитих в целлоидин.
Ножі, які відносяться до групи В. називаються плоско-увігнутими. але кривизна увігнутій поверхні у них значно менше. ніж у ножів групи А. Вони виготовлені з більш твердої сталі, використовують їх для приготування целлоідінових і целлоидин-парафінових зрізів.
У ножів, що відносяться до групи С. обидві поверхні клинка плоскі. Їх виготовляють з твердої сталі і застосовують для різання об'єктів, залитих в парафін, а також для отримання зрізів на заморожувати мікротому.
Крім того, для приготування парафінових і напівтонку зрізів на мікротомів і ультратомах використовують металеві магнітні леза і скляні ножі. Металеве магнітне лезо (одноразовий ніж) дозволяє отримати зрізи з 50-60 парафінових блоків, потім лезо змінюють.
Заточення мікротомних НОЖЕЙ
Отримати якісні гістологічні зрізи при целлоідіновой, целлоидин-парафінової і парафіну заливці матеріалу можна за допомогою мікротомних ножа, товщина леза якого повинна бути від 3 до 5 мкм. Для роботи на заморожувати мікротому необхідно мати гострий ніж без зазубрин на лезі. Ніж необхідно своєчасно точити, а перед кожною різкою об'єктів правити.
Мікротомних ножі заточують за допомогою спеціальних апаратів, наприклад «Sakura» (Японія). Однак до сих пір не втратила актуальності і застосовується в багатьох лабораторіях ручна заточка ножів. Вручну мікротомних ножі точать на камені, що має форму бруска. Жовті й, так званий бельгійський камінь використовують для заточування першим, потім продовжують заточку на білому камені (Арканзас), який має більш дрібну зернистість. Можна використовувати природний аспідний камінь, який також має грубозернисту і дрібнозернисту поверхню.
Перед заточкою на поверхню каменю наносять машинне масло або гас, гліцерин, розведений 70% спиртом (1: 1), мильну воду. На спинку ножа надягають спеціальний обушок (бажано постійно використовується для заточування одних і тих же ножів - це визначає кут заточування), а в стрижень або отвір в торцевій частині ножа вкручують ручку. Потім ніж кладуть обушком на камінь, по якому ковзає і лезо під дією власної ваги. Ніж проводять по каменю з одного кінця на інший, а потім, повертаючи через обушок, здійснюють рух в зворотному напрямку.
Тривалість процесу залежить від кваліфікації лаборанта і стану різальної крайки ножа. В середньому вона становить від 30 хв до 1 год. Періодично контролюють якість заточування, обережно укладаючи ніж на предметний столик мікроскопа і переміщаючи його так, щоб ріжуча кромка проходила через поле зору при малому збільшенні. Потім ніж правлять на широкому ремені, натягнутому на дерев'яну колодку. Правку проводять так само, як і заточку (через обушок).
Мікротомів І ОСОБЛИВОСТІ РОБОТИ НА НИХ
Мікротоми - це прилади, за допомогою яких отримують зрізи тканин, залитих в різні середовища, а також заморожених і нефіксованих. Мікротоми дозволяють отримувати гістологічні зрізи різної товщини. За принципом дії розрізняють санні, ротаційні, заморожують мікротоми. а такжекріостати і вібратоми.
Санні мікротоми характеризуються горизонтальним рухом ножа і вертикальним підйомом блокодержателя. Їх з успіхом використовують для різання об'єктів, залитих в целлоидин, целлоидин-парафін і парафін. Основні частини мікротома розташовуються на спеціальних санчатах, звідси походить його назва. Принцип роботи санного мікротома полягає в тому, що при зворотному ході ножа ножові санчата штовхають стрижень зі шкалою регулятора подачі, викликаючи його переміщення. Рух стрижня передається на тягу, яка за допомогою «собачки» повертає храповик. Обертання храповика передається мікрогвинти, який за допомогою рознімної гайки переміщує санчата з блоком вгору. З кожним зрізом блок піднімається все вище на відстань, відповідне товщині зрізу. Після того як блокодержатель досягне найвищої точки, за допомогою рознімної гайки треба опустити санчата з механізмом в крайнє нижнє положення. Існують інші різновиди санних мікротомів з різними варіантами способів подачі, затискачів для ножів і т.д.
Ротаційні мікротоми призначені для різання парафінових блоків, з їх допомогою можна отримувати серійні зрізи. Найважливіша частина ротаційного мікротома - механізм мікроподачі, який включає в себе храповик, диференційний механізм, мікрогвинт, лімб, косозубой передачу і кулачок. Приводний механізм при повороті вала за допомогою «собачки» повертає на задану кількість зубів храповик, на осі якого знаходиться зубчасте колесо, передає через шестерню обертання мікрогвинти. Гвинт переміщує каретку подачі об'ектодержателя. Товщина зрізів встановлюється поворотом лімба.
Об'ектодержатель ротаційного мікротома - гвинтовий затиск, вмонтований в кульову оправу каретки подачі. Шарнірний механізм дозволяє подати блок під будь-яким кутом. Об'ектодержатель фіксується в затиску спеціальною рукояткою.
Тримач для ножа - масивна підставка з двома вертикальними стійками, в які вмонтовані рухаються власники, пристосовані для установки ножа під потрібним кутом. Фіксація ножа здійснюється гвинтами. У переднезаднемнапрямі ніж переміщається по спеціальних напрямних за допомогою гвинта. Поступово наближаючи ніж до об'єкта і одночасно повертаючи колесо подачі, підрівнюють площа різання, а потім ніж фіксують.
Ротаційні мікротоми забезпечені спеціальною транспортною стрічкою, на яку з ножа потрапляє смужка (серія) зрізів. На стрічці їх поділяють препаровальной голками і виробляють подальші маніпуляції. Знімати зрізи з ножа ротаційного мікротома можна пензликом або препаровальной голкою.
Заморожують мікротоми використовують для різання не залита, але фіксованих об'єктів, матеріалу, залитого в желатин і водорозчинні пластмаси. Особливо широко застосовуються заморожують мікротоми для виготовлення препаратів при дослідженні матеріалу термінових біопсій. За своєю конструкцією заморожують мікротоми відносяться до мікротомів санного типу, але в їх пристрої є деякі особливості. Станина має пристосування для кріплення до столу. Ніж встановлюють під потрібним кутом в рухомий ручки за допомогою одного або двох затискачів. Автоматична подача здійснюється за кожному розмаху ручки з ножем
через систему важелів. Заморожують столик забезпечений пристосуванням для подачі вуглекислоти або охолоджується мають термоелектричного за допомогою напівпровідникових елементів.
Кріостати, вібратоми. З розвитком гистохимии ферментів і іммуноморфологіі виникла необхідність в обробці нефіксованого матеріалу, яка була реалізована за допомогою спеціальних приладів - криостатов. Пізніше з'явилися кріокіти і вібратоми.
Кріостат - спеціалізована холодильна камера з встановленим в ній мікротомів, в якій є отвори для рук, люмінесцентна лампа і оглядове скло. Надійна ізоляція дозволяє підтримувати в криостате температуру від -5 до -25 ° С. Негативними моментами при роботі з криостате є значне переохолодження рук оператора, недостатня освітленість робочого поля, а також неможливість орієнтувати об'єкт щодо кромки ножа. Ці недоліки практично усунуті вкріокітах зарубіжного виробництва, управління якими винесено за межі морозильної камери. У них можна окремо регулювати температуру об'єкта і ножа. Через 3-5 хв після включення приладу досягається низька температура, причому охолодження можливо до -65 ° С, що запобігає утворенню кристалів у тканинах.
Догляд за мікротомів і мікротомних ножами. Все ковзаючі поверхні мікротомів повинні бути чистими і змащені тонким шаром машинного або вазелінового масла. При постійній роботі на мікротому все ковзаючі поверхні необхідно один раз на тиждень протирати ганчірочкою, змоченою бензином або толуолом, і змащувати. Після закінчення роботи на мікротому об'ектодержатель і станину очищають від залишків парафіну, попередньо вийнявши мікротомних ніж і прибравши його в футляр. Мікротомних ножі ніколи не залишають в мікротому або на робочому столі! Заморожують мікротоми і кріостати через 30 хв після вимкнення витирають насухо і кручені подачу змащують вазеліновим маслом.
РІЗАННЯ парафінові БЛОКІВ НА санному мікротомів
Парафіновий блок, наклеєний на дерев'яну колодку або без неї (з великим шаром парафіну), затискають в об'ектодержатель. Встановивши потрібний кут нахилу ножа (оптимальний 13-15 °) в залежності від щільності тканини, повільно підводять ніж до блоку, регулюють його висоту до зіткнення з ножем. Спочатку вирівнюють поверхню блоку, встановивши мікрометричними шкалу на отримання товстих (20-25 мкм) зрізів, потім шкалу переводять на б -8 мкм і приступають до різання матеріалу. Як правило, ніж розташовується перпендикулярно, але можливо також отримання зрізів (особливо з більш щільних об'єктів) ножем, який встановлений під кутом до станини мікротома.
Зрізи з блоку обережно знімають за допомогою сухої або змоченою в спирті пензлика, використовують також вигнуту препаровальной голку або скальпель. Зрізи зазвичай переносять в коробку, дно якої вистелене папером чорного кольору, і укладають матовою стороною вгору. Після отримання потрібної кількості зрізів поруч з ними кладуть блок або етикетку з номером. Зручніше відразу обробити 20-30 блоків, а потім приступити до монтування зрізів на предметні скельця.
Часто зрізи наклеюють на предметне скло безпосередньо з ножа. Для цього їх переносять в склянку з теплою (35-40 ° С) дистильованої або кип'яченою водою, а потім виловлюють на предметні скельця, які попередньо знежирюють і натирають білком з гліцерином. Зрізи приклеюють на предметне скло блискучою, зверненої до ножа стороною. Невеликі складочки на зрізі можна розправити, обережно торкаючись до них кутом зігнутою препаровальной голки.
Можна розправляти зрізи безпосередньо на склі за допомогою спеціального пристосування для сушки і розправлення парафінових зрізів. Для цього на предметне скло піпеткою наносять краплю води і в неї опускають зріз. Скло зі зрізом поміщають на нагрівається столик приладу, де зріз поступово розправляється. Після видалення надлишку води піпеткою або фільтрувальної папером скло зі зрізом підсушують і одночасно зріз щільно фіксується на предметному склі. На нагрівається столику приладу поміщається одночасно 45 предметних стекол, при його використанні не потрібно подальшого просушування стекол зі зрізами в термостаті. Є спеціальні імпортні ванночки для розправлення зрізів і перенесення їх на скло. У них постійно підтримується оптимальна температура води 38 ° С.
Тривалість просушування зрізів в термостаті при 37 ° С 6-12 ч. У разі необхідності проведення термінової забарвлення зрізи можна помістити на 10-15 хв в термостат при 56 ° С до початку плавлення парафіну, що сприяє кращій фіксації зрізу на предметному склі. Однак при цьому кілька ускладнюється депарафінірованіе: потрібно застосування додаткової порції ксилолу та збільшення тривалості депарафінірованія.
Існує сухий спосіб приклеювання зрізів до скла, який придатний тільки для зрізів відмінної якості. На предметне скло, змащене тонким шаром білка з гліцерином, поміщають зріз, акуратно розправляють його препаровальной голкою або скальпелем і злегка підігрівають на спиртівці або нагрівається столику.
Приготування ЦЕЛЛОІДІНОВИХ зріз
Для приготування целлоідінових зрізів використовують ножі типу А і Б. Целлоідіновие блоки закріплюють так само, як і парафінові. Після установки ножа в мікротом до нього підсувають об'ектодержатель з укріпленим в ньому блоком. Вирівнюють поверхню блоку до тих пір, поки повністю не оголиться тканину шматочка, а потім приступають до приготування зрізів бажаної товщини. Під час різання ніж і об'єкт рясно змочують 70% або 80% спиртом, користуючись пензликом. Ніж по санчатах мікротома ведуть плавно, без тиску. Отриманий зріз розправляють на ножі за допомогою пензлика, після чого зріз знімають з ножа на подушечку вказівного пальця, підкладеного під ніж. Зрізи кладуть в склянки з 70% спиртом.
ПІДГОТОВКА предметно СТЕКОЛ
Предметні скла, застосовувані для отримання гістологічних препаратів, необхідно попередньо подготовіть.Ісключеніе складають готові до використання і спеціально упаковані імпортні предметні скельця.
Предметні скла миють в теплій мильній воді або кип'ятять в 2-3% розчині бікарбонату натрію, потім промивають гарячою водою і промивають протягом кількох годин у проточній воді. Вимиті скла протирають чистою тканиною і на кілька днів поміщають в суміш Нікіфорова: 96% спирт і ефір (1: 1). Знежирені скла витягають пінцетом з цієї суміші, протирають чистою тканиною і складають в коробочку.
Для знежирення предметних стекол використовують також хромовую суміш, до складу якої входять 100г біхромату калію, концентрованої сірчаної кислоти і 1000 мл гарячої води. Біхромат калію розчиняють спочатку в гарячій воді, потім розчин охолоджують і після цього по скляній паличці обережно по краплях додають сірчану кислоту. Скло витримують в хромової суміші 2-3 дня, а потім ретельно промивають в проточній воді протягом 1-2 днів.
Предметні скла також добре обезжирюються в міцному розчині соляної кислоти. Через кілька діб їх промивають проточною водою і висушують.
Якість знежирення можна перевірити, капнув на предметне скло воду з піпетки: по знежиреному склу вода розтікається тонким шаром, а не збирається в краплю.
Для кращої фіксації зрізів на склі його попередньо змащують сумішшю білка з гліцерином. Свіжий яєчний білок збивають і фільтрують через великопористий фільтр, змочений дистильованою водою, потім розмішують з рівним об'ємом гліцерину і додають кілька кристалів тимолу. Суміш зберігається протягом декількох місяців. Застосовують також суміш, до складу якої входять 15 мл сироватки крові, 5 мл дистильованої води і 6 мл 5% формаліну. Після фільтрації суміш готова до нанесення на предметні скельця. Її використання дає кращі результати, ніж застосування яєчного білка, так як при фарбуванні не утворюється фон.
Розроблено спосіб фіксації зрізу до предметного скла без попереднього натирання останнього білком з гліцерином. У ванночку з теплою дистильованою водою капають кілька крапель рідкого казеїнового клею і перемішують. В отриману мутнувату рідина опускають зрізи, розправляють препаровальной голкою і виловлюють на чисте знежирене скло. Цей спосіб дає незмінно хороший ефект і навколо зрізу відсутня пофарбований фон, як це часто буває при застосуванні білка.