Постійна клітинна лінія для вирощування вірусів

Постійна клітинна лінія для вирощування вірусів. Безперервне культивування вірусів.

Постійна (безперервна) клітинна лінія - це клітини, здатні субкультивована поза організмом протягом необмеженої кількості пасажів. На рівні знань про поведінку культивованих клітин неможливо визначити точку, коли культура стає стабільною, т. Е. Набуває здатності рости до безкінечності. Тільки на основі досвіду з фібробластоподібних клітини людини показано, що культура повинна субкультивована, по крайней мере, 70 разів з інтервалом приблизно в три дні, перш ніж її можна буде вважати постійної (безперервної) лінією клітин.

Всі культури з необмеженою здатністю до розмноження ( «безсмертні культури») слід називати постійними (безперервними) або стабільними лініями. У вірусологічної літературі широко поширений термін «перещеплюваних лінії клітин», під яким маються на увазі лінії клітин, здатні до нескінченного зростання поза організмом.

Під трансформацією клітин мають на увазі незворотні генетичні зміни. характеризуються зміною ростових властивостей культивованих клітин. Трансформація робить клітини безсмертними і менш залежними від поживних чинників і геометричних параметрів зростання. Зміна ростових властивостей пов'язано зі зміною транспортування поживних речовин через клітинну мембрану і є однією з адаптивних особливостей, що дозволяють клітинам розмножуватися в умовах, несприятливих для трансформувалися батьківських клітин.

Зміна клітинної мембрани супроводжується втратою поверхневого білка (150 кБ) і зміною антигенних властивостей. Основна перевага трансформованих клітин - здатність до нескінченного розмноження і поліпшені ростові властивості. Трансформовані клітини можуть утворювати пухлини у імунологічно толерантних тварин. З цієї причини трансформацію іноді неправомірно прирівнюють до злоякісних змін. Первинні культури клітин, лінії диплоїдних і трансформованих клітин отримали широке застосування в вірусологічної практиці і стали основою створення великомасштабних систем культивування клітин і виробництва вакцин.
Це, в свою чергу, зажадало вдосконалення методів культивування. організації комерційного виробництва середовищ і апаратури для культур клітин.

Отримання постійних ліній набагато розширило дослідження в галузі клітинної біології та вірусології. На їх основі з'явилася можливість отримання мутантних і гібридних ліній клітин, що відкрило перспективу створення нових субстратів, придатних для культивування вірусів. Нормальні клітини вдається субкультивована поза організмом протягом обмеженої кількості пасажів, після чого їх розмноження припиняється і вони, як правило, гинуть. Це зазвичай відбувається приблизно після 50 генерацій, якщо клітини отримані з тканин дорослого організму.

Лише іноді вони здатні продовжувати розмножуватися в культурі необмежено довго, перетворюючись в так звані трансформовані постійні клітинні лінії. Трансформація клітин в культурі має поліетіологічним природу. Спонтанна трансформація культур клітин нормальних тканин - відносно рідкісне подія. Частоту таких трансформацій можна збільшити, обробивши клітини мутагенами або деякими вірусами.

Всі постійні клітинні лінії. на відміну від культур нормальних клітин з обмеженим терміном життя, є трансформованими, т. е. зміненими по ряду ознак, головним з яких є «безсмертя». Здатність до невизначено тривалого розмноженню в культурі, як правило, пов'язана з анеуплоїдних кариотипом. Деякі лінії клітин (наприклад, фібробластів хом'ячка - ВНК-21) хоча і володіють правильним диплоїдним числом хромосом, але їх каріотип, мабуть, змінений. Інші критерії трансформації (онкогенність, контактне гальмування вимоги до середовища) проявляються у різних ліній неоднаково.

Всі вони отримані в результаті спонтанної або індукованої трансформації клітин в організмі або в культурі. Багато відбуваються з пухлин тварин, хоча не завжди при експлантаціі пухлинних клітин in vitro утворюються клітинні лінії. Лінії клітин, отримані безпосередньо з пухлинних тканин (тобто трансформованих в організмі), часто зберігають спеціалізовані функції, наприклад, здатність продукувати деякі ферменти протягом більш тривалого періоду, ніж клітини, трансформовані в культурі різними методами (фізичними, хімічними, вірусними агентами ). Частота отримання постійних ліній у різних видів ссавців неоднакова.

Клітини мишей піддавалися спонтанної трансформації значно частіше, ніж клітини людини або інших ссавців. Вказані відмінності, мабуть, пов'язані з неоднаковою стабільністю каріотипу різних видів тварин.

Субкультівірованія клітин. а потім і становлення постійної клітинної лінії, були більш успішними, коли первинну однослойную культуру отримували шляхом посіву механічно подрібненої тканини, ніж з суспензії трипсінізірована клітин. Можливо, це пов'язано зі зменшенням кількості білка в поверхневих структурах клітин в результаті обробки трипсином. Для трансформації клітин часто використовують віруси. Клітини нирки новонародженого хом'яка (ВНК), наприклад, легко трансформуються вірусом поліоми або вірусом SV-40, а клітини ембріона хом'яка - герпесвірусом типу 3 коней. В останньому випадку клітинні лінії експресували вірус-специфічні білки, але не продукували вірусного потомства.

Трансфекція культури клітин нирки ембріона людини онкогеном вірусу SV-40 збільшувала період розмноження in vitro від 15-20 до 70-90 поколінь. З популяції таких клітин вдалося виділити дві постійні лінії, практично не мають ознак трансформації. В результаті трансфекції гепатоцитів нормальних щурів ДНК вірусу SV-40 отримана серія клітинних ліній SV-40 гепатоцитів. За допомогою рекомбінантного вектора SV-40-аденовірусу отримані розрізняються за властивостями постійні лінії клітин строми кісткового мозку людини, що експресують великий Т-антиген вірусу SV-40. Т-штам вірусу ретікулоендотеліоза курей викликав трансформацію культур клітин печінки, селезінки, кісткового мозку, а також тимуса курячих ембріонів і молодих курчат. Переважна більшість трансформованих ліній клітин секретувати вірус, що викликає летальний ретикулоендотеліоз у 1-2-денних курчат.

Кращими сайтами інтеграції вірусного генома виявилися ламкі ділянки в геномі ссавців, що обумовлено, мабуть, їх структурними і функціональними особливостями. Результатом взаємодії вірусного і клітинного геномів можуть з'явитися хромосомні аномалії і придбання клітинами здатності до необмеженого розмноження.

При тривалому культивуванні клітинні лінії можуть змінювати ті чи інші властивості, тому для підтримки вихідних властивостей расплодкі клітин, їх зберігають при низькій температурі і періодично беруть для розмноження і практичного використання. Наприклад, в процесі багатьох циклів вирощування клітин ВНК-21 в одношарової культурі можуть значно змінюватися їх первинні властивості. Нормальний рівномірне зростання фібробластоподоб-них клітин може змінитися зростанням епітеліоподобних клітин, що утворюють шари і грона. Від властивостей сироватки також залежить швидкість росту клітин і чутливість до різних типів і штамів вірусу ящура.
Більшість таких змін характерно для трансформованих клітин інших ліній.