папіломавірусна інфекція
Велика група папилломавирусов стала ефективно вивчатися порівняно недавно. Спонукальна причина інтенсивного вивчення цих вірусів пов'язана з тим, що деякі з них асоціюються з виникненням злоякісних пухлин аногенітальний області. Серед пухлин генітальної локалізації особливе місце займає рак шийки матки, вірусна етіологія якого доведена цілим рядом епідеміологічних досліджень і підтверджена присутністю в тканини пухлини ДНК певних типів вірусів папіломи людини (ВПЛ).
ВПЛ - дрібні ДНК-віруси, характерна особливість яких полягає в здатності викликати проліферацію епітелію шкіри і / або слизових оболонок. ВПЛ не розмножуються в культурі клітин, тому відомості про біології вірусів отримані за допомогою молекулярно-генетичних технологій і епідеміологічних досліджень. Показано існування 100 типів, що відрізняються за будовою ДНК, 75 з них молекулярно клоновані і повністю секвенувати. Типування ВПЛ грунтується не на антигенних відмінностях, а на ДНК-гомології.
Серед 30 типів ВПЛ, які вражають аногенітальну область, розрізняють типи високого і низького онкогенного ризику. ВПЛ виявляють в 93% випадків інвазивного раку аногеніталій, при цьому 50% з них - ВПЛ 16.
Встановлено статевий шлях передачі ВПЛ. Внаслідок частого безсимптомного перебування ВПЛ в організмі інфіковані люди часто не знають про те, що вони інфіковані. Нещодавно з'явилися генітальні бородавки більш інфекційних, ніж давно існуючі.
Різке зниження імунітету, що спостерігається при СНІДі, при лікуванні цитотоксичними препаратами, супроводжується реактивацией латентної папплломавірусной інфекції, що клінічно проявляється у вигляді утворення множинних папілломатозних розростанні.
Як відбувається реплікація вірусу, збірка вірусних частинок і їх вивільнення з клітки, вважати повністю встановленими ще не можна. Відомі 2 способи реплікації - постійна реплікація епісомного генома в базалиюм шарі епітелію і вегетативна реплікація в більш диференційованих клітинах гранулярного шару. Реплікація епісомного генома відбувається постійно, але кількість копій ДНК низька. Вегетативна реплікація відбувається в ядрах клітин, де генерується потомство ВПЛ. Вивільнення вірусних частинок відбувається в результаті дегенерації десквамованих клітин.
У міру вивчення ВПЛ гібридизаційним методами розширюється коло вірусів високого онкогенного ризику. Це ВПЛ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68. Вірусами низького онкогенного ризику залишаються 5 типів ВПЛ - 6, 11, 42, 43, 44. ВПЛ 16 найбільш часто зустрічається в тканини плоскоклітинного раку шийки матки, ВПЛ 18 - в тканини залозистого раку - аденокарциноми.
У табл. 6.7 наведені типи ВПЛ, які виявляються при різних ураженнях шкіри і слизових оболонок.
Типи ВПЛ, виявлені при різних ураженнях шкіри і слизових оболонок
(Villiers Е. М. 1989)
2, 6, 11, 16, 18, 30
Застосування методів визначення ДНК ВПЛ підвищує ефективність виявлення передракових станів, по-перше, тому, що чутливість методів надзвичайно висока, їх Предсказательная рівень незрівнянно вищий, ніж цитологічного методу; по-друге, стандартизація молекулярно-біологіческпх методів досяжна, в той час як цитологічні дослідження з працею можна привести до одного стандарту.
Неампліфікаціонние методи в звичайній діагностичної практиці в даний час не застосовуються, вони використовуються в наукових цілях.
У табл.6.8 наведено основні молекулярно-біологічні методи, використовувані для визначення ДНК ВПЛ.
Методи виявлення ДНК ВПЛ
Дот-блот, Саузерн-блот гібридизація, гібридизація in situ
Полімеразна ланцюгова реакція - ПЛР
Лігазнля ланцюгова реакція - ЛЦР
Система гібридної пастки - "Digene Hybrid Capture System II"
Ампліфікаціонних методи, метою яких є виявлення характерних для типу ВПЛ олігонуклеотидів в досліджуваному матеріалі і множення їх кількості за допомогою ПЛР або ЛЦР, називають ампліфікацією мішені. У світі використовується кілька стандартних реактивів для всіх типів ВПЛ, в нашій країні практично використовуються праймери лабораторного приготування.
Не зупиняючись детально на мішень-амплифицируют методах, звернемося до сигнальних ампліфікаціонних методам, які не вимагають обмежень у лабораторній практиці, характерних для ПЛР-лабораторій.
Система подвійної генної пастки - "Hybrid Capture II" фірми Abbott (США), застосовується без тих обмежень, які необхідні при використанні ПЛР. Вона забезпечує:- комп'ютерну інтерпретацію результатів, що виключає суб'єктивізм в оцінці;
- відтворюваність і достовірність результатів;
- повний цикл дослідження за один день.
Система "Digene Hybrid Capture II" використовує РНК-ДНК гібридизацію в розчині з подальшою "хвостовій" іммунологнческой реакцією між гібридом РНК проби - ДНК мішені і специфічними антитілами до цього гібриду. Тест зобов'язаний своєю високою специфічністю декільком незалежним складовим.
По-перше, мішенню є весь геном ВПЛ. Довга одноцепочечная РНК ефективно гібрідізіруют з усіма 8000 нуклеотидів ДНК ВПЛ. Гібрид ДНК-РНК стабільніший, що дозволяє уникнути небажаних побічних реакцій.
По-друге, джерелом додаткової чутливості реакції є використання антитіл до РНК-ДНК гібриду, кон'югованих з безліччю молекул лужноїфосфатази. Ці мічені антитіла розпізнають короткі ланцюжки РНК-ДНК гібрида способом, який не має відношення до послідовностей нуклеотидів ДНК і РНК. Тисячі молекул антитіл можуть покрити одиничний геномної гібрид ДНК ВПЛ.
По-третє, кожен іммобілізований ензим лужноїфосфатази реагує з безліччю молекул хемілюмінесцента діоксетана за 1 хвилину і викликає постійний потік фотонів, які підраховуються фотомультіплейерной трубкою люмінометра.
По-четверте, система генної пастки має перевагу перед природною ампліфікацією, так як залучає великий обсяг (10-20%) клінічного матеріалу в реакцію.
У гібридної пастці використовуються РНК-проби, комплементарні до повної геномної послідовності 13 канцерогенних і 5 типів ВПЛ низького онкогенного ризику. Складаються "коктейлі" високого і низького ризику відповідно. Кожен "коктейль" окремо інкубується з денатурированной (одноцепочечной) ДНК з клінічного матеріалу. Утворюється РНК-ДНК гібрид переноситься в лунки мікропанелі, на яких іммобілізовані моноклональні антитіла до РНК-ДНК гібриду. Антитіла специфічно розпізнають гібрид, який прикріплюється до лунки панелі. Уловлені таким чином РНК-ДНК гібриди потім вступають в реакцію з моноклональними антитілами до гібриду, міченими лужною фосфатазою, що вносяться в кожну лунку. Надлишок антитіл і негібрідізірованних молекул видаляють промиванням. В лунки додають люминесцирующий субстрат діоксетан. Якщо субстрат руйнується лужною фосфатазою, то відбувається випускання світла. Емісію світла можна виміряти за допомогою люмінометра. Кількість світла генерується в пропорції до числа мішеней ДНК в зразку.
Аналітична чутливість системи - 0,2 пг / мл (1000 копій генома ВПЛ).
Визначення ВПЛ з використанням "Digene Hybrid Capture II" є ефективним доповненням до цервікальної цитології і може допомогти знизити захворюваність і смертність від цервікального раку.