Лабораторна діагностика ротавірусної інфекції великої рогатої худоби - студопедія

Ротавірусна інфекція (РВІ) ВРХ (діарея неонатальних телят) - остропротекающая контагіозна хвороба новонароджених телят, що характеризується ураженням шлунково-кишкового тракту. Хвороба широко поширена у всіх географічних регіонах земної кулі. Практично її ре-гістріровалі всюди, де проводили дослідження. Доведено широка диссиминация ротавірусів (РВ) телят серед тварин різних видів і наявність АТ у гризунів (морських свинок, щурів, хом'яків, мишей).

На підставі епізоотологічних, клінічних і патологоанатомічних даних ставлять попередній діагноз, остаточний встановлюють лише лабораторньм методами. Останні базуються на виявленні вірусу або вірусного АГ в фекалії хворих телят, вмісті кишечника, клітинах слизової оболонки тонкого кишечника полеглих і вимушено забитих тварин, а також на виявленні АТ до РВ в сироватках крові хворих і перехворілих телят і в сироватках крові та молозиві корів -матерей.

Експрес-методи діагностики. Розроблено тест-система ІФА на основі РВ свиней при виявленні специфічного АГ РВ ВРХ, яка має високу чутливість і специфічність. Її доцільно застосовувати в лабораторних умовах для експрес-діагностики. Оскільки поліпептид VР5 містить перехресний груповий АГ, локалізується-ний в консервативному домені, який є загальним для всіх РВ групи А. Як і казана можливість індикації рота- і коронавірусів методом флюоресцентних зондів і АТ до них. Він заснований на реєстрації ранніх етапів взаємодії вірусів з рецептора-ми клітин.

Виділення вірусу. У лабораторію для дослідження направляють не менше 10 проб рідких фекалій, тонкий кишечник з вмістом (не пізніше 2-3 год з моменту загибелі або вимушеного забою телят), 10-15 проб парних сироваток хворих і перехворілих живіт-них, 6-10 проб сироватки крові корів і 6-10 проб молозива. З найбільшою сталістю вірус вдається виявити в пробах фекалій, взятих в перші дні хвороби, тому для ис-проходження придатні фекалії, взяті від 2-14-дн телят з клінічними ознаками діареї на 1-3-й день хвороби. Відразу ж після доставки в лабораторію проби обробляють або зберігають при 4 ° С не більше доби, при -20-50 ° С до 1 міс. Сироватки крові зберігають при 4-10 ° С не більше 1 тижня, при -20 ° С до 1 міс; молозиво - при 4 ° С не більше 2 діб, при -20 ° С - до 1 міс. Для вірусологічних або електронно-мікроскопічних досліджень готують 10% -ву суспензію фекалій на розчині Хенкса. Суспензію гомогенізують і центрифугують 1 ч при 3 тис. Об / хв, надосадову рідину переносять в стерильний флакон, додають пені-циллин і стрептоміцин (по 1000 ОД / мл), витримують 10-12 год (ніч) при 4 ° С і досліджують.

Виділення РВ в культурі клітин. Показана кореляція між захворюванням новоро-дження телят діареєю з присутністю РВ АГ в фекаліях. Слід мати на увазі, що звичайні-ними методами вірус не культивується, а застосування додаткових впливів - хи-вів (трипсин) і фізичних (центрифугування вірусу на шарі клітин) - дає поло-тивних результати при високих концентраціях вірусу в фекаліях, що перевіряється електронної мікроскопією. Для цього вміст однієї пробірки після заморожування і відтавання і обробки поліетиленгліколем ресуспендіруют в 0,1 мл дистильованої води і досліджують в електронному мікроскопі. У позитивному випадку виявляють ті-пічних частки РВ і їх скупчення. Специфічний характер частинок підтверджують мето-дом іммуноелектронной мікроскопії.

При позитивному результаті РВ частки виявляються в препаратах у вигляді специфи-чеських скупчень (імунних комплексів). Оцінку специфічності реакції проводять шляхом підрахунку числа і розмірів подібних скупчень, а також за ступенем покриття окремих віріонів АТ сироватки. Виразність цього ефекту при певному навику можна оцінювати за шкалою умовних одиниць від 0 до 4-х плюсів.

ІФ. Для виявлення вірусного АГ в заморожених зрізах тонкого кишечника, маз-ках фекалій і культурі клітин успішно застосовують прямий і непрямий методи. При дослі-джень кріосрезов кишечника і мазків з фекалій телят кращі результати отримують протягом 4-6 годин після виявлення ознак діареї. Епітеліальні клітини швидко десква-міруются з поверхні ворсинок кишечника і видаляються з фекальними масами. Найчастіше суспензією фекалій заражають культуру клітин і ідентифікують вірусний АГ в ре-акції ІФ. Розроблено прямий метод ІФ в клітинах МДВК, інфікованих культуральним або фекальним вірусним матеріалом. У методичних рекомендаціях по інді-кации РВ ВРХ непрямим методом ІФ передбачається використання діагностичного набору, що включає антиген специфічний - культуральне вируссодержащую сусп-зию клітин ПЕК або МА-104; АГ нормальний - неінфікованих суспензію клітин ПЕК або МА-104; специфічну сироватку, отриману шляхом гипериммунизации телят, лабо-раторно тварин; нормальну сироватку від здорового ВРХ, що не містить АТ до РВ; антивидові сироватку проти глобулінів ВРХ, кон'югованих ФИТЦ (випускає Ін-ститут епідеміології та мікробіології ім. Н.Ф. Гамалії). Ніф можна використовувати для виявлення та ідентифікації РВ АГ в інфікованих культурах клітин, фекаліях і ки-шечника хворих і полеглих телят для виявлення і кількісної оцінки АТ до РВ.

РДП. Це - простий і доступний метод виявлення РВ АГ в фекаліях хворих телят, вмісті кишечника і суспензії слизової оболонки кишечника полеглих або винуж-денно убитих телят. Для цього 20% -ву суспензію фекалій в фосфатно-буферному сольовому розчині прогрівають на водяній бані при 37 ° С 30 хв, періодично перемішуючи. Потім цін-тріфугіруют 15 хв при 8000 g. Надосадову рідину фільтрують через фільтр "Мілліпор" і фільтрат концентрують в 25 разів за допомогою діалізного концентратора. У резуль-таті всіх етапів обробки 0,2 мл концентрату відповідає 1 г вихідного матеріалу Фека-лий. Джерелом специфічних АТ служать сироватки реконвалесцентів після ротавірус-ного гастроентериту, попередньо перевірені в інших серологічних реакціях.

РДП проводять в гелі агарози на скляних пластинках 0,9% агарози в буферному розчині, що містить 0,1 М NaС1, 0,01 М трис (гідроксиметил) -амінометана і 0,001 М етілендіа-мінтетраацетата. Компоненти реакції поміщають в вирізані в шарі агарози лунки діа-метром 3 мм, віддалені один від одного на 3 мм. Платівки з гелем витримують протягом ночі при кімнатній температурі, після чого враховують результати. Між лунками з АГ і АТ в позитивних випадках формується одна чітка лінія преципітації. У РДП випробовується АГ - рідка частина фекалій або Надосадова рідина після центрифугування суспензії фекалій або кишечника, випробувана сироватка від перехворілих телят, молозі-во і молоко в натуральному вигляді (у вигляді сироватки) після обробки сичуговим ферментом.

Реакція иммунопреципитации з фарбуванням преципитатов флюоресцирующими АТ може застосовуватися дляобнаруженія в фекаліях РВ людини і РВ діареї телят. Розробити конструкцію тана її прискорена модифікація. Діагностикум, що включає специфічний і нормальний АГ, специфічну сироватку, готують за методикою ВІЕВ, а в якості нормаль-ної сироватки використовують фетальну сироватку або сироватку безмолозівних телят. Ре-акцію оцінюють за освітою характерних ліній преципитата.

РСК. Для виявлення АГ застосовується рідше інших методів. Вона менш чутлива, ніж електронна мікроскопія і РИФ, частіше дає хибнопозитивні результати через антікомплементарние багатьох проб фекалій. Однак при обробці фекалій комплементом, фетальної сироваткою, фреоном, очищенням ПЕГ 6000 або ультрацентрифугирование РСК не поступається по чутливості електронної мікроскопії. Реакцію ставлять мікрометодом зі специфічною сироваткою або сироваткою недавно перехворіли телят, вільної від АТ до інших вірусів.

ВІЕФ. При цій реакції утворюється лінія преципітації між АГ, що рухаються до анода, і АТ, що рухаються до катода. Якість і чистота агарози є основним факто-ром отримання відтворюваних результатів. Більшість дослідників вважають, що цей тест не поступається електронної мікроскопії або навіть перевершує її.

ВІЕФ запропонований для виявлення РВ в фекаліях і патологічному матеріалі та для виявлення АТ в сироватках крові. Для дослідження беруть рідку частину фекалій. Якщо для дослідження рідкої частини недостатньо, то проби фекалій центрифугируют 10-15 хв при 4 тис. Об / хв при 4-10 ° С. Досліджують надосадову рідину. Кишечник дрібно подрібнюють, додають рівний об'єм фізіологічного розчину, потім гомогенізують в ступці зі склом, центрифугують 10-15 хв при 2 тис. Об / хв при 4-10 ° С. Надосадову рідину використовують в реакції.
ВІЕФ ставлять в 0,85% -му розчині агарози, приготовленої на 0,5 М веронал-медіналовом буфері (рН 8,6).

ЕLISА. За чутливості вище, ніж ЕІ, ІФ, РСК, ВІЕФ. Може бути вико-ван в прямому і непрямому варіантах, а також в постановці на латексі. За допомогою ЕLISА можна виявити РВ в фекаліях телят при розведенні досліджуваної проби до 1: 5000. Опі-сан твердофазний ЕLISА для типування і ділення на підгрупи РВ людини і живіт-них. Для цього використовують IgG в концентрації 5 мкг / мл; розведення кролячій антісиво-Ротко до IgG ВРХ до 1: 400. Тривалість інкубації IgG -4 год, реакції АГ РВ з IgG -3 ч, реакції антисироватки до РВ з комплексом IgG - РВ АГ -16 год, для з'єднання з кон'югатом - 4 год, для зміни кольору субстрату (фосфату Р-нітрофеніл) - 10 хв. Перед дослі-нанням фекалії телят розводять в 4 рази фосфатно-буферним розчином, освітлюють центрифу-гірованіем і обробляють сумішшю Твін-20 з азидом натрію. Показання ЕLISА в 100% випадків збігаються з результатами електронної мікроскопії.

Розроблено тест-система ІФА на основі РВ свиней для виявлення специфічного АГ РВ ВРХ, яка має високу чутливість і специфічність. У Укаїни розроблений імуноферментний диагностикум, що випускається ВІЕВ. Набір включає: специфічний ліофілізований РВ АГ - віруссодержащего суспензія, отримана на культурі клітин МА-104, концентрована ПЕГ 6000 і центрифугували при 6000g, контрольний АГ, ліофілізована специфічна антіротавірусная Сивоя-ротика, отримана шляхом гипериммунизации телят або кроликів вірусом, очищеним в градієнті щільності хлористого рубідію; сухі імуноглобуліни, виділені з гипе-ріммунной антіротавірусной сироватки методом висолювання насиченим розчином (NН4) 2 SО4 з подальшою ионообменной хроматографією на колонці з ДЕАЕ-целюлозою.

Існує ряд інших методів для виявлення РВ АГ в фекаліях хворих на діарею телят: реакція зворотної пасивної гемаглютинації, метод іммуноагрегатной ГА, реакція аглютинації латексу та ін. Так, запропонований простий стафілококовий метод для виявив-ня РВ в фекаліях новонароджених телят з використанням кролячій сироватки до РВ ті-лять. Метод заснований на виявленні РВ агглютинируют стафілокока в 10% -ої сусп-зії зразків фекалій на предметних стеклах з золотистим стафілококом, навантаженим РВ АТ. Контролем служать стафілококи, оброблені неиммунной кролячій сироваткою. Аглютинація видно під мікроскопом через 2-3 хв після кругового похитування скла. Щоб уникнути неспецифічних реакцій проводять попередню обробку зразків фекалій нагріванням, фільтрацією і И-ацетилцистеином. Така обробка не знижує спе-ціфічності методу. У порівнянні з ЕLISА даний метод виявився більш чутливими; переваж-вин його - швидкість, простота і низька вартість, що дуже важливо для скринінгу біль-шого числа зразків фекалій.

Метод аглютинації латексу з використанням комерційного набору Rotalех для ви-явища РВ в фекаліях хворих настільки ж специфічний, чутливий, як і методи елек-тронної мікроскопії, ІФ та ЕLISА. Для диференціації підгруп і серотипів ізолятів РВ описаний метод гібридизації нуклеїнових кислот, електрофорез в ПААГ віріонів РНК вірусів. Метод точкової гібридизації високо специфічний, дозволяє виявляти 8 нг вірусної РНК і в 10-100 разів більш чутливий, ніж ЕLISА.

Варіантна ідентифікація за допомогою монАТ. Отримано монАТ до шт. RIT4237 (серотип I) РВ ВРХ. Нейтралізація АГ виявила вариабельную специфічність до групових і подгрупповие детерминантам. Використанням монАТ проти субгруппових АГ в ЕLISА було встановлено домінування серотипу II РВ людини в пробах калу хворих дітей. Наявність таких АТ збільшує чутливість і специфічність тест-систем.

Серодиагностика і ретроспективна діагностика. Серологічне дослідження сироваток крові телят має вельми обмежену цін-ність. Протягом перших тижнів життя не вдається виявити приросту АТ, незважаючи на минулий хвороба. Рівень гуморальних АТ у дорослих тварин не дозволяє прогнив-зировать виникнення епізоотії в стаді.

РСК. Для діагностики РВІ показана можливість постановки РСК з парними Сивоя-Ротко перехворілих тварин. У перші дні хвороби КСА у більшості тварин від-сутствуют. До 7-10 дня рівень їх зростає, досягаючи максимуму до 21-го дня, потім від-ходить зниження, і до 30-35 дня титр КСА доходить до нуля. РСК ставлять загальноприйнятим ме-тодом в мікро- і макрооб'ємів.

РГГА. Ставлять за стандартною методикою, використовуваної діагностичними вірусологі-) тичними лабораторіями. Застосовують скляні пробірки і звичайні обсяги реагентів або одноразові пластикові панелі з лунками і мікрооб'єми реагентів. Для поста-новки реакції використовують еритроцити людини групи О або еритроцити морської свинки. Досліджувані сироватки обробляють каоліном і еритроцитарної масою (останнє - при використанні еритроцитів людини). Все розведення готують на фізіологічному сольовому розчині з додаванням 0,04% альбуміну сироватки ВРХ.

Непряма ІФ, РН, радіоімунологічний метод ставляться по загальноприйнятим ме-Тодика.

Диференціальна діагностика. Рви у новонароджених телят слід дифференци-ровать від коронавирусной інфекції, колібактеріозу. Необхідно виключати диспепсію новонароджених телят аліментарного походження. Для титрування вірусів групи А розроблені методи дот- і блот-гібридизації РНК з зондами до ДНК геномного сегмента 4, отриманими за допомогою ампліфікації в ПЛР гіпердівергентних областей гена білка VР4 (нуклеотиди 211-686) до ДНК шт. ІК, IND, NCDV і Сr з використанням олігонуклеотидних праймерів. Зонди 3 тіпоспеціфічни (VР4) і не реагують перехресно з 2-Стек гілок РНК гетерологичних Р-типів РВ.