Гост 25753-83 тварини сільськогосподарські
Наші ціни нижчі, ніж в інших місцях, тому що ми працюємо безпосередньо з постачальниками документів.
способи доставки
Поширюється на велику рогату худобу, овець, свиней та інших тварин (хутрових звірів, собак і кішок), неакцінірованних живими вакцинами, і встановлює методи лабораторної діагностики хвороби Ауєскі
Обмеження терміну дії зняте: Протокол № 3-93 МГС від 12.03.93 (ІКС № 5-93)
з 01.07.84 до 01 -07.8 »
Недотримання стандарту переслідується по закону
Цей стандарт поширюється на велику рогату худобу, овен, свиней та інших тварин (хутрових звірів, собак і кішок), невакцинованих живими вакцинами, і встановлює методи лабораторної діагностики хвороби Аусскі.
Стандарт застосовують при діагностуванні захворювання тварин в лабораторіях ветеринарних науково-дослідних установ.
Стандарт повністю відповідає СТ РЕВ 3454 81.
1. МЕТОД ВІДБОРУ ПРОБ
1.1. Для проведення біологічної проби і виділення вірусу патологічний матеріал беруть від тварин в період максимального прояву клінічних ознак хвороби (температурна реакція, пригнічення, нервова клініка, свербіж, расчеси). Від вимушено забитих і загиблих тварин патологічний матеріал повинен бути взятий і досліджено в літню пору протягом б год. А за умови зберігання його в охолодженому стані протягом 10-12 год.
1.2. В лабораторію доставляють хворих тварин, трупи тварин або шматочки тканин і органів (головного і спинного мозку, легенів, печінки, селезінки, лімфатичних вузлів, мигдаликів), від абортованих тварин -плоди і плаценту.
1.3. Дли серологічного дослідження проби покрівлі від досліджуваних тварин беруть в стерильні пробірки і кількості не менше 5 см 3.
сторінка 4
Op. 2 ГОСТ 257J3-®J
Сироватку отримують методом відстою до зберігають її до 10 діб при температурі плюс 4 ° С. Допускається більш тривале зберігання сироватки при температурі мінус 20 ° С. Сироватка повинна бути прозорою без ознак гемолізу.
1.4. Патологічний матеріал доставляють у лабораторію з супровідним документом, в якому вказують найменування господарства, вид і вік тварини, епізоотичних дані, клінічну і патолого-анатомічну картину, відомості про проведення імунізації тварин і застосовуваної вакцині.
2. МЕТОД вІОЛОГІЧЕСКОЙ Прово
Суть методу полягає у відтворенні захворювання у здорових кроликів шляхом інокуляції патологічного матеріалу.
2.1. Апаратура, матеріали і реактиви Для проведення випробування застосовують:
центрифугу з частотою обертання не менше 3000 об / хв;
термостат з температурою нагреаа 37 С С;
шприци місткістю 1 або 2 см 3;
розчин фізіологічний стерильний, pH = 7,2;
розчин сольовий буферний стерильний, pH- * 7,2;
антибіотики широкого спектру дії.
2.2. Підготовка до дослідження
2.3. Проведення дослідження
Для проведення біологічної проби використовують кроликів масою 2-2,5 кг. Надосадову рідину, приготовлену по п. 2.2, вводять двом кроликам внутрішньом'язово в дозі 1-2 см 3.
2.4. Обробка результатів
Бнопробу вважають позитивною, якщо тварини гинуть з клінічними ознаками хвороби Ауєскі (нервова клініка, свербіж, расчеси) через 2-10 діб після інокулнровання суспензії патологічного матеріалу. Якщо тварини гинуть без призна-
сторінка 5
ГОСТ 2575J- »3 Стор. 3
ков хвороби Ауєскі, биопробу повторюють, використовуючи патологічний матеріал першого пасажу.
Загибель кроликів після введення суспензії патологічного матеріалу від свиней без ознак сверблячки і расчесов може свідчити про виділення вакцинних штамів вірусу хвороби Ауєскі.
Загибель кроликів після введення суспензії патологічного матеріалу від хутрових звірів без ознак сверблячки і расчесов може свідчити про виділення вакцинних штамів вірусу хвороби Ауєскі, шатогенних для хутрових звірів.
Для ідентифікації вірусу проводять виділення вірусу в культурі клітин з наступною постановкою реакції нейтралізації.
3. МЕТОД ВИДІЛЕННЯ ВІРУСУ У КУЛЬТУРАХ КЛІТИН
Суть методу полягає у виявленні цнтопатіческого дії (ЦПД) вірусу в культурі клітин і його подальшої ідентифікації.
3.1. Апаратура, матеріали і реактиви Для проведення дослідження застосовують: термостат з температурою нагріву 37 ° С; центрифугу з частотою обертання не менше 3000 об / хв; ваги лабораторні з похибкою зважування не більше 0.01 г;
шафа сушильна; мікроскоп будь-якої марки; холодильники; баню водяну;
апарат для тріпсіннзацін тканин; піпетки мірні по ГОСТ 20292-74; пробірки скляні згідно з ГОСТ 25336-82; чашки Петрі по ГОСТ 25336-82; фільтри стерилізують різних розмірів; розчин сольовий буферний стерильний, pH-7,2; середовища ростовую поживну і похчержіваюшую; розчин трипсину;
сироватку великої рогатої худоби для культури клітин; антибіотики та препарати мікостатнческіе; феноловий червоний по ГОСТ 4599-73; розчин тріпана блакитного;
культуру клітин первинно-трнпсіннзірованних нирок і щитовидної залози свині, сім'яників телят, ембріонів курей, клітинні. лінії РСІ. ВМК21 (будь-яку з перерахованих);
сторінка 6
вірус хвороби Ауєскі з титром не нижче Ю 1 ТЦД »ЛЧ>;
сьгворогку тварин, що не містить антитіл до вірусу хвороби Ауєскі (негативну);
сироватку специфічну гнпернммунную проти хвороби Ауєскі (позитивну).
3.2. Підготовка до і з сл од про в а н н я - по п. 2.2.
3.3. Проведення дослідження
У пробірки з культурою клітин вносять по 0,2 см 3 кожного випробуваного матеріалу. Для кожної проби використовують 4-6 пробірок. Пробірки із зараженою культурою клітин витримують в термостаті при 37 ° С протягом 30 хв. Потім з пробірок з культурою клітин видаляють надосадову рідину і додають 1,8 см 3 підтримуючої живильного середовища, що містить антибіотики.
В контролі використовують 4 6 пробірок з незараженной культурою клітин, в якій проводять зміну живильного середовища. Пробірки із зараженою культурою клітин і контрольні інкубують при температурі 37 а С протягом 2-5 діб і щодня мнхроскопіруют для обліку цітопатіческнх змін. При появі цітопатнческнх змін культуральну рідину з кожної пробірки об'єднують і роблять ідентифікацію виділеного вірусу. Якщо випробуваний матеріал токсичний для клітин або неможливо визначити специфічність ЦПД, проводять додатковий пасаж.
3.4. Обробка результатів
Результат дослідження випробуваного матеріалу вважають позитивним. якщо в культурі клітин виявляється цнтопатоген-ве дію вірусу, яке проявляється в округленні клітин, появі гігантських клітин і клітинному лизисе з відпадінням уражених клітин від скла.
У контрольних культурах (незаражених) не повинно бути цнтопатнческах зміні.
За результатами вірусологічного дослідження хвороба Ауєскі діагностують, якщо видова приналежність виділеного вірусу в культурі клітин підтверджена в реакції нейтралізації (метод ідентифікації вірусу).
МЕТОД ІДЕНТИФІКАЦІЇ ВІРУСУ
Сутність метола полягає в виявленні придушення пігопатнческого дії вірусу в культурі клітин за допомогою позитивної сироватки.
4. Апаратура а, матеріали і реактиви -по п. 3.1.
сторінка 7
ГОСТ 2J753-83 Crp. 5
4.2. Проведення дослідження
Перед постановкою реакції нейтралізації позитивну і негативну сироватки розбавляють в співвідношенні 1:10 живильним середовищем для культури клітин, що містить антибіотики, і прогрівають на водяній бані при температурі 56 ° С протягом 30 кін. Б два ряди пробірок (по 7 шт.) Вносять по 2 см 8 сироватки в кожну пробірку: в перший ряд - позитивну, в другій - негативну.
Готують десятикратні розведення випробуваного вірусу від 10 1 до I0- 1 на живильному середовищі для культури клітин в обсягах, достатніх для постановки реакції, і вносять в два ряди пробірок з сироватками, починаючи з розведення I0 -7. в обсязі по 2 см 3 на пробірку. Пробірки з сумішшю розведень вірусу і сироватки встряхнваюг і витримують в термостаті при температурі 37 ° С С протягом 1 ч. Потім кожну суміш сироватки з разведениями вірусу вносять по 1 см 3 в 4 пробірки з культурою клітин. Пробірки інкубують в термостаті при температурі 37 ° С.
4.3. Обробка результатів
Результати реакції враховують по цнтопатнческому дії вірусу через 2-5 діб. Для цього визначають титр досліджуваного вірусу в присутності позитивної та негативної сироваток і зиражают його в логарифмах ТЦД $. ; «*. Титр обчислюють за методом Ріда і Менчи. Видову приналежність вірусу встановлюють при наявності різниці в титрах вірусу з негативною і позитивною сироватками не менше ніж на два логарифма.
Готують дворазові розведення досліджуваних сироваток від 1 • 2 до 1. 16 на живильному середовищі для культури клітин з анти-
сторінка 8
Cip. 6 ГОСТ 2J7SJ-83
біотікамн. Потім готують необхідний обсяг вірусу, що містить 1000 ТЦДдасі і додають рівний об'єм його в кожну пробірку з послідовними розведеннями сироваток. Суміш сироваток і вірусу струшують, витримують при температурі 37 ° С протягом I ч, після чого в -1 пробірки з культурою клітин вносять по 0,2 см 3 суміші сироватки і вірусу і витримують при температурі 37 ° С протягом 30 хв. Після закінчення зазначеного терміну в пробірки з культурою клітин вносять по 1,8 см * підтримуючої живильного середовища. Одночасно ставлять такі контролі:
контроль незаражених культур клітин в 3-4 пробірках, в яких проводять зміну живильного середовища;
контроль дози вірусу. Для контролю точності дози вірусу, взятої в реакцію, з робочого розведення вірусу (1000 ТЦД $ о, о.1си>) готують розведення до 10
4. Для кожного розведення вірусу використовують 3-4 пробірки з культурою клітин. У пробірки з культурою клітин вносять робоче розведення вірусу і послідовні його розведення в об'ємі по 0,1 см *. Після контакту при температурі 37 ° С протягом 30 хв в пробірки з культурою клітин додають 1,9 см 3 підтримуючої живильного середовища;
контроль токсичності сироватки. Для визначення токсичності сироватки в пробіркових культури вносять по 0,1 см 3 розведення сироватки і по 1,9 см 3 підтримуючої живильного середовища (по 3-А пробірки з культурою клітин на кожне розведення сироватки);
контроль специфічності вірусу. Пробірки з культурою клітин інфікують сумішшю вірусу в робочій дозі з дворазовим розведенням специфічної сироватки до її титру (по 3-4 пробірки з культурою клітин для суміші кожного розведення специфічної сироватки + вірус).
Всі пробірки з культурами клітин, які використовуються в- реакції, інкубують при температурі 37 ° С С.
Проводять щоденний мікроскопічний контроль клітинних культур. Облік реакції проводять при появі цітопзті-чеського дії вірусу в контролі дози вірусу, взятої для реакції нейтралізації.
3.4. Обробка результатів
Результат серологічного дослідження досліджуваних сироваток вважають позитивним при відсутності цитопатичної дії про раз веденнях сироватки 1: 2 і вище при наявності наступних результатів в коітролях:
в контролі культури клітин не повинно бути змін моно-c. юя клітин;
сторінка 9
в контролі дози вірусу цітопатнческое дія повинна бути в робочому розведенні вірусу і і розведеннях 10 ', 10 ". 10 -3 і 10 4 (в останньому розведенні не менше двох пробірок);
в контролі 'токсичності сироваток в разі позитивно)! сироватки (перехворілих тварин) відсутня цітопатіческнй ефект, починаючи з розведення сироватки 1: 2; при негативній сироватці (відсутні специфічні антитіла) повинен бути цітопатіческнй ефект, як і в культурах з контролем дози вірусу (робоче розведення);
в контролі специфічності вірусу відсутня цітопатіческнй ефект в культурах, інокульованої сумішшю специфічної сироватки і вірусу.
Наявність специфічних антитіл в досліджуваних сироватках крові свідчить про інфікування даної особини, групи тварин збудником хвороби Ауескн або можливої вакцинації тварин проти хвороби Ауєскі.
Позитивний результат серологічного методу дослідження сироваток крові невакцшшрованних тварин свідчить про підозру на захворювання, яке підтверджують постановкою біологічної проби.
сторінка 10
Коректор Е. І. Еетеева
Сд ** 0 ь ІАБ 05С6.83 Підпис в п «ч. 07.05 * 3 0.W5 п. Я. 0.48 уч.- над я Тир 6<Х» Цена 3 доп.
Ордена «Зіак Шана *» Видавництво стандартів. 11І5Т. Київ. Новооресіенскмй вер. 3 ТМИ. «Мс<ковсг.нА зечаткмк». Киев. Лплид пер. в. Зак. 527