Генна інженерія методи генної інженерії - конструювання рекомбінантних ДНК

Генна інженерія рослин

Конструювання рекомбінантних ДНК

Під рекомбінантними розуміють ДНК, утворені об'єднанням in vitro (у пробірці) двох або більше фрагментів ДНК, виділених з різних біологічних джерел. Ключовими в цьому визначенні є слова "фрагмент ДНК" і "об'єднання in vitro", що вказує на сутність генетичної інженерії та її відмінність від всіх інших методів отримання гібридних (або химерних) організмів, таких як генетична селекція, ембріональна інженерія і т.д.

Фрагменти ДНК, в тому числі і фрагменти, що містять гени, отримують з використанням ферментів рестриктаз. Рестріктази можуть утворювати фрагменти як з тупими, так і з липкими кінцями. Зшивання фрагментів ДНК проводиться трьома основними методами, які залежать від того, які кінці мають фрагменти зшиваються ДНК.

Зшивання по однойменною "липким" кінців (рестріктазного лігазну метод)

Цей метод є найпоширенішим і популярним. Вперше цим способом гібридна ДНК була отримана С. Коеном з співробітниками в 1973 році. Деякі рестріктази, наприклад Pst I, вносячи в ланцюзі ДНК симетричні, розташовані навскіс один від одного розриви на рівних відстанях від центру сайту впізнавання і утворюють "сходинку" (рис. 36). Ці комплементарні один одному ділянки мають тенденцію до асоціації за рахунок спарювання підстав, і тому їх називають комплементарними або липкими кінцями. Парування підстав відбувається тільки між комплементарними послідовностями, тому ААТТ-кінці, утворені Eco RI, що не будуть спаровуватися, наприклад, з АГЦТ-кінцями, утвореними Hind III. Але будь-які два фрагмента (незалежно від їх походження), що утворилися під дією однієї і тієї ж рестріктази, можуть злипатися за рахунок утворення водневих зв'язків між однониткових ділянками комплементарних нуклеотидів (рис. 39).

Мал. 39. Схема рестріктазного - лігазну методу

Однак після такого спарювання повної цілісності подвійної спіралі не відновиться, оскільки залишиться два розриву в фосфодіефірнимі кістяку. Для його відновлення, тобто зшивання, або лігування ниток використовують фермент ДНК-лігази. Цей фермент в живій клітині виконує ту ж функцію - зшивання фрагментів ДНК, що синтезуються при реплікації.

Зшивання по "тупим" кінців (коннекторние метод)

Липкі кінці не абсолютно необхідні для зв'язування фрагментів ДНК. Тупі кінці також можуть бути з'єднані за рахунок дії ДНК-лігази, якщо і лігаза, і тупі кінці присутні в реакційній суміші в високих концентраціях. У цьому випадку реакція лигирования має свої особливості і її ефективність нижче, ніж при зшивці по липким кінців. Вперше такі експерименти були виконані в 1972 році Полем Бергом в Стенфордському університеті, США. Липкі кінці також можна ферментативним шляхом приєднати до молекул ДНК з тупими кінцями. Для цього використовують фермент - кінцеву трансферазу з тимуса теляти, яка приєднує нуклеотиди до 3-кінців ланцюгів ДНК. Якщо до 3'-кінців одного з рекомбініруемих in vitro фрагментів ДНК за допомогою кінцевий дезоксинуклеотидилтрансферазой добудувати одноцепочечниє олиго (dA) -сегмент певної довжини, а до кінців іншого фрагмента - оліго (dT) -сегмент приблизно такої ж довжини, то при змішуванні отриманих таким чином фрагментів відбувається спарювання за рахунок утворення водневих зв'язків між олиго (d А) - і олігo (dT) послідовний (рис. 40). Для ковалентного з'єднання двох фрагментів використовується ДНК-лігаза. Ці процедури складають основу для другого загального методу отримання рекомбінантних молекул ДНК.

Мал. 40. Пришивання «липких» решт і зшивання фрагментів ДНК

Оскільки можна формувати досить довгі взаімокомплементарние одноцепочечниє кінці, гібридні молекули утворюються з високою ефективністю. Зокрема, тому при клонуванні ДНК-копій матричних РНК, які доступні в обмежених кількостях, зазвичай іс¬пользуют коннекторние метод. При такому способі з'єднання між фрагментами вбудовуються ділянки ААААА. Такі додаткові послідовності ТТТТТ можуть впливати на функції з'єднуються молекул і тому завжди, коли тільки можливо, для отримання рекомбінантних молекул ДНК користуються липкими кінцями, що утворилися в результаті дії рестриктаз.

Зшивання фрагментів з різнойменними липкими кінцями

У ситуації, коли необхідно зшити фрагменти, утворені різними ендонуклеаза рестрикції, і мають різні, тобто некомплементарни один одному липкі кінці, застосовують так звані лінкери (або "перехідники"). Лінкери - це хімічно синтезовані олігонуклеотиди, що представляють собою сайти рестрикції або їх комбінацію. Вперше цю ідею запропонував Шеллер з співробітниками в 1977 році.

Існують великі набори таких генних "перехідників". Природно, що при використанні лінкерів повинна враховуватися необхідність дотримання правил експресії генетичної інформації. Часто в середину линкера поміщають будь-якої регуляторний генетичний елемент, наприклад, промотор або ділянку, пов'язаний з рибосомою. В цьому випадку лінкери забезпечують не тільки об'єднання генів, але і обумовлюють їх експресію. Існують лінкери "тупий кінець - липкий кінець".

При необхідності липкі кінці можна перетворити в тупі. Це досягається або отщеплением липких кінців за допомогою ферменту - ендонуклеази S1, яка руйнує тільки одноцепочечную ДНК, або липкі кінці »забудовують", тобто за допомогою ДНК-полімерази I на однониткових липких кінцях синтезують другу нитку.

Інші розділи: