Фарбування і висновок зрізів - основи гістології
Сторінка 44 з 68
Для того щоб зріз, приготований одним із зазначених вище способів, можна було дослідити в мікроскоп, необхідно, щоб структурні компоненти складових його тканин були добре помітні в світлі і щоб зріз був захищений від можливого забруднення і пошкодження. Тому подальша обробка зрізу передбачає його фарбування, просвітлення і висновок.
загальні зауваження
Незважаючи на те, що фарбування зрізів має давню історію, до теперішнього часу повністю незрозуміла суть механізмів дії багатьох барвників. Безсумнівно лише, що в основі фарбування тканинних мікроструктур лежать фізико-хімічні процеси. З фізичних факторів в першу чергу слід відзначити явища дифузії (проникнення), адсорбції (поверхневе вбирання) і абсорбції (глибоке просочування) барвника, а також його розчинність, з хімічних - електролітичні властивості фарбувальних розчинів і самих тканин. Важливе значення мають щільність тканин і дисперсність барвника. Перше властивість визначає послідовність фарбування окремих структур, друге - швидкість процесу фарбування.
Саме на електролітичних властивостях грунтується поділ застосовуваних в гістологічної практиці барвників на три групи: основні, кислотні і нейтральні.
Основний барвник є барвник підставу або його сіль і забарвлює клітинні і тканинні структури кислої природи, наприклад хроматин ядра, що містить ДНК, і ядерце, що містить РНК. Звідси і термін базофилия (люблячий підставу) для позначення тканинних компонентів, забарвлюються основними барвниками (метіонін, гематоксилин, метиловий зелений і ін.).
Кислотний барвник - це барвна кислота або її сіль, в силу чого він забарвлює речовини і частки основної природи, наприклад гранули еозинофільних лейкоцитів, цитоплазму деяких клітин передньої долі гіпофіза і ін. Звідси і термін оксіфілія (ацидофільний - люблячий кислоту) для тканинних елементів, фарбувальних кислотними барвниками. У цю групу речовин входять еозин, еритрозин, кислотний фуксин, конго червоний і ін.
Нейтральний барвник утворюється при з'єднанні водних розчинів кислотного і основного барвників (з'єднання фарбувальної кислоти з барвником підставою). До цієї групи належать судан, еозіновокіслий метиленовийсиній і ін.
Не слід плутати нейтральний барвник з нейтральною фарбувальної сумішшю, для якої характерно одночасно присутність в розчині основного і кислотного барвників. Термін же нейтрофилия застосуємо до результатів фарбування обома групами барвників, так як відображає не властивість барвника, а рівновага між кислотними і основними властивостями офарблюваних елементів.
Слід пам'ятати, що на якість забарвлення і її стійкість значний вплив можуть надавати спосіб фіксації, попередня і наступна обробка препаратів. Тому потрібно строго дотримуватися всі методичні вказівки та загальні правила фарбування.
Необхідно також підкреслити, що більшість гістологічних барвників неспецифічно, т. Е. Не розкриває хімічну природу тканинних компонентів. З їх допомогою можна вивчати лише морфологічні особливості мікроструктур.
Барвники, що застосовуються для гістологічних цілей, ділять на природні та штучні.
Розрізняють декілька типів гістологічного фарбування: прогресивний, регресивний, прямий, непрямий, простий і складний.
Прогресивне фарбування - це такий спосіб, при якому зрізи знаходяться в барвнику до тих пір, поки не досягнуть необхідного рівня окрашиваемости.
Регресивний - зрізи спочатку перефарбовують, а потім доводять до необхідної забарвлення шляхом відмивання в відповідної рідини, що дозволяє більш чітко виділити окремі елементи тканин.
Слід постійно пам'ятати: а) про ретельному видаленні відмивали рідини (в іншому випадку вона буде продовжувати діяти і спотворить результат забарвлення); б) про найбільш зручною застосуванні тонких зрізів; в) про те, що розведені барвники дають кращі результати, ніж міцні розчини (товсті зрізи і висока концентрація барвника ускладнюють диференціювання і призводять до нерівномірного забарвленням зрізів); г) про те, що забарвлення потрібно проводити під контролем мікроскопа.
Застосування регресивних методів забарвлення вимагає певної навички, який набувається поступово.
Пряме фарбування - фарбування об'єкта безпосередньо в розчині барвника, непряме (протравні) - зріз фарбують потрібним барвником лише після попередньої обробки спеціальними протравними барвниками.
При простому фарбуванні застосовують один барвник. Складне фарбування передбачає обробку препарату декількома барвниками (двома і більше) одночасно або послідовно (див. Забарвлення гематоксилін-еозином, фарбування за методом Ван-Гізоном).
Всі методи гістологічного фарбування можна розділити на дві основні групи: а) оглядові, використовувані для отримання загального орієнтовного уявлення про досліджуваному об'єкті (фарбуються переважно ядра і цитоплазма клітин); б) спеціальні, які дозволяють фарбувати саме ті тканинні і клітинні елементи, які цікавлять дослідника (органели клітини, волокнисті структури і т. д.). Методи, що становлять другу групу, більш складні і вимагають особливих способів фіксації.
Для того щоб отримати хороші результати при будь-якому методі забарвлення гістологічних препаратів, необхідно дотримуватися певних правил.
- Фарбувальні розчини повинні бути чистими, тому будь-який барвник необхідно перед вживанням відфільтрувати, а водний розчин готувати тільки на дистильованої воді.
Мал. 77.
Розташування біологічних стаканчиків (батарея) для послідовної обробки наклеєних на скло зрізів (депарафінірованіе, зневоднення).
- Віддавати перевагу: а) фарбування барвниками низькій концентрації протягом тривалого часу перед короткочасної забарвленням барвниками високої концентрації; б) застосування регресивних методів.
- Ретельно виконувати всі процедури при підготовці зрізу до фарбування і подальшої його обробки.
техніка фарбування
В результаті цих маніпуляцій зріз і прилеглі ділянки предметного скла покриваються тонкою целлоідіновой плівкою, завдяки якій і досягається зміцнення зрізу і на склі. Після цього зріз промивають в дистильованої воді і фарбують.
Проведення фарбування. При фарбуванні водними барвниками зрізи переносять з дистильованої води, а при фарбуванні спиртовими - зі спирту відповідної концентрації безпосередньо в фарбувальний розчин (пряме фарбування) або спочатку в рідину для протруєння (непряме фарбування). Коли препарат набуває потрібну інтенсивність забарвлення, його промивають у воді (або спирті) для видалення надлишку барвника, а потім, якщо потрібно, диференціюють у відповідній рідини. Зайвий барвник відмивають до тих пір, поки він не перестає переходити з зрізу в відмивати рідина.
Фарбування зрізів, наклеєних на скла, можна проводити шляхом як приміщення їх в фарбувальний розчин, так і наколювання барвника на зріз. У першому випадку застосовують скляні стаканчики, кювети або спеціальні металеві стійки, які дозволяють одночасно фарбувати велика кількість (до 40-50) стекол (рис. 79). Для фарбування наколюванням в плоскі чашки або ванночки кладуть паралельно скляні палички, на які укладають предметні скельця. Для того щоб палички не зміщувалися, кінці їх з'єднують гумовою трубкою. Після цього на зріз за допомогою піпетки накапують розчин
барвника. Якщо фарбування тривалий, то щоб уникнути випаровування барвника місце розташування зрізу накривають маленьким годинниковим склом або чашкою. Подібний ефект можна отримати, помістивши предметні скельця з накапати барвником в чашку Петрі, одночасно поклавши поруч змочену у воді вату. Після того як чашка буде закрита, відбувається зволоження повітря, що веде до значного зменшення випаровування барвника розчину. Фарбування свободноплавающих зрізів, як і при попередній підготовці, ведуть в бюксах або на часових стеклах.