Ембріональні стовбурові (ес) клітини загальні відомості

Ембріональні стовбурові (ЕС) клітини: загальні відомості

Ембріональні стовбурові клітини (embryonic stem cells): недиференційовані клітини, отримані з раннього ембріона, які можуть підтримувати тривалу реплікацію і перетворюватися на безліч типів диференційованих клітин. Стовбурові клітини служать в якості постійного джерела нових клітин. При перенесенні в інший ранній ембріон вони можуть комбінувати з внутрішньої клітинної масою цього ембріона і включатися в процес розвитку, даючи химерних тварин. Вони можуть при цьому входити в число клітин зародкового шляху.

Первинні культури цих клітин отримують з клітин бластоцисти (внутрішньої клітинної маси) або з первинних статевих клітин ранніх постімплантаціонних зародків. При вирощуванні на поживному шарі з ембріональних фібробластів ЕСК зберігаються в недиференційованому стані від 3 міс. до 1 року. При цьому вони можуть бути кілька разів заморожені і відтанула без втрати здатності до диференціювання. ЕСК, введені в бластоцель (порожнину бластоцисти), зберігають свою тотипотентність і можуть брати участь у формуванні практично всіх ембріональних зачатків і органів зародка. В результаті утворюється тварина - химера - що складається з клітинних клонів двох різних типів: клітин вихідного батьківського генотипу і ЕСК. Якщо ці клітини розрізняються, наприклад, по генам забарвлення шерсті, тварина-химера - матиме поперечну або плямисту забарвленість. При цьому всі тварини, незалежним чином отримані в результаті введення в однакові за генотипом зародки однієї і тієї ж лінії клітин, будуть відрізнятися один від одного за характером плямистості, так як все химери різні по набору клітинних клонів, які розвинулися і диференціювати з введених в зародок ЕСК . Химерні тварини, у яких ЕСК диференціювалися в статеві клітини і дали початок повноцінним зрілим гаметам, будуть стійко передавати своїм нащадкам генетичну інформацію, що міститься в ЕСК. Таких тварин іноді називають зародковими трансмітерами. При схрещуванні їх з мишами дикого типу частина нащадків будуть уже гетерозіготни по мутантом генам ЕСК, т. Е. Нестимуть мутацію в гаплоидном стані в кожному типі клітин. Це в рівній мірі відноситься і до мутацій, попередньо штучно введеним в ЕСК. Схрещуючи такі гетерозиготи, можна отримати тварин, гомозиготних по заданій мутації. Природно, останнє можна досягти тільки в тому випадку, якщо мутація бракуватиме летальної в гомозиготному стані у тварин цього виду.

Можливість вести селекцію потрібних мутантних або трансгенних клонів ЕСК і лише потім їх використовувати в якості клітинних векторів знайшла широке застосування в генетичному моделюванні. Спочатку для цієї мети ЕСК обробляли різними мутагенами (етілнітрозомочевіной), відбирали клони клітин, які мають мутацію в потрібному гені, і потім використовували їх для створення ін'єкційних химер Гарднера. Таким способом на мишах була отримана модель хвороби Леш-Нихана - мутація гена гіпоксантінфосфорібозілтрансферази [Hooper M. et al. 1987].

Випадки стабільної інтеграції екзогенної ДНК можуть бути легко виявлені, якщо трансфецірующіе плазміди або вектора містять селектіруемих маркерний ген. Найчастіше в якості маркера використовують прокариотический ген Nео. повідомляє клітинам стійкість до неоміцину. Клітини, в яких відбулася інтеграція такої плазміди в хромосомну ДНК, будуть утворювати стійкі клони при вирощуванні на середовищі G418, що містить неоміцин, в той час як всі інші клони клітин будуть в цих умовах деградувати.

Візьмемо 4,5 денну передімплантаційної бластоцисту. Внутрішню клітинну масу з бластоцисти помістимо на моношар клітин, які постачають матрикс для прикріплення і ростові фактори (це так звані фідерні, що живлять клітини).

Ростові фактори підтримують плюрипотентні характер стовбурових клітин. пригнічуючи їх диференціювання. В таких умовах клітини внутрішньої клітинної маси пролиферируют і в слушний час її видаляють мікропіпеткою.

Диспергируют отримані клітини і висівають на новий фідерний шар. Виросли колонії досліджують під мікроскопом і відбирають ті з них, які мають характерну морфологію ES клітин Беруть відповідні колонії. ресуспендіруют і висівають на фідерний шар. В результаті отримують колонії ES клітин, що зберігають плюріпотентность і здатні давати химерних тварин.

Проробимо експеримент, схематично представлений на рис. 6.

Візьмемо отримані ембріональні клітини від чорної гомозиготной миші і введемо в бластоцисту миші, гомозиготною по аллели albino.

Підсадимо цю бластоцисту ложнобеременной миші і дозволимо їй народити потомство. У потомстві вийдуть химерні миші, содержашийся як клітини - нащадки чорної гомозиготи, так і клітини-нащадки білої гомозиготи. Це зрозуміло? Шкурка цих мишей буде плямистої. Ця плямистість і є знак хімерізма.

Схрестимо отриманих химер з гомозиготними альбіноса. У потомстві отримаємо якусь кількість чорних мишей. Ці чорні миші вийшли в результаті того, що частина підсаджені ембріональних стовбурових клітин від чорної миші включила міститься в них інформацію в клітини зародкового шляху потомства. Це дуже важливий результат, який показує, що такий шлях можна використовувати для створення трансгенних тварин.

Тепер можна використовувати ES-клітини для того, щоб ввести в них чужорідну ДНК. Це можна зробити різними способами, наприклад, Електропорація або за допомогою ретровірусів. Зазвичай використовують перший з них. І потім можна селектировать ті клітини, які отримали і стабільно підтримують чужорідну ДНК. Відібравши потрібні клітини in vitro, введемо їх в миша точно так, як це було розказано тільки що. Трансдуцірованние клітинні клони зберігають плюрипотентні характер.

Вам вже ясно, що ми революціонізували весь процес? Замість того щоб відбирати трансгенних тварин, ми селектіруем стовбурові клітини, використовуючи прекрасно розвинені методи генетики соматичних клітин. Див. Трансгенні організми: використання клітин ліній ES і EK