Діагностика криптоспоридіозу телят, контент-платформа

ДЕРЖАВНА освітня установа вищої професійної освіти "МОСКОВСЬКА ДЕРЖАВНА АКАДЕМІЯ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ І БІОТЕХНОЛОГІЇ

ІМЕНІ К. І. СКРЯБІНА "

М. Ш. Акбал, Н. В. Есаулова, О. Є. ДАВИДОВА,

С. А. Шем'якову, Д. Н. Шемяку

ДІАГНОСТИКА криптоспоридіоз ТЕЛЯТ

М. Ш. Акбал, Н. В. Есаулова, О. Є. ДАВИДОВА, С. А. Шем'якову, Д. Н. Шемяку. Діагностика криптоспоридіозу телят: Методичні рекомендації. М. ФГОУВПО «МГАВМиБ ім. », 20с.

Описано методи діагностики криптоспоридіозу телят з урахуванням епізоотології, симптомів хвороби і сучасних лабораторних методів досліджень.

Призначена для студентів факультету ветеринарної медицини, ветеринарно-біологічного факультету і фахівців ветеринарного профілю.

Рецензент: і. о. зав. кафедрою клінічної діагностики і хвороб молодняку ​​професор

Затверджено на засіданні навчально-методичної комісії ФВМ ФГОУВПО «МГАВМиБ ім. »Від 01.01.01 р протокол.

Криптоспоридіоз - гостро або підгостро протікає захворювання молодняка тварин, що викликається найпростішими з роду Cryptosporidium, сімейства Cryptosporidiidae, загону Coccidiida, класу Coccidea, типу Sporozoa (6).

У ссавців криптоспоридіоз викликають два види - C. parvum і C. muris (4). Кріптоспорідіі не мають вузької видовий специфічності щодо господарів. Ооцистами від телят успішно заражали ягнят, козенят, щурів, мишей у віці від 3 до 5 днів (Heine, Boch, 1981). Криптоспоридіоз був діагностований у 12 людей, що мали прямий контакт з телятами в період спалаху у них криптоспоридіозу (хвороба виявлялася діареєю і спазмами в області живота) (Reese, 1982).

У природі джерелами інвазії є дикі і синантропні гризуни, кішки, собаки, птахи, у яких криптоспоридіоз протікає без виражених симптомів хвороби (14). У телят криптоспоридіоз характеризується ураженням шлунково-кишкового тракту, клінічні ознаки хвороби реєструють переважно у віці 2-20 днів. Необхідною умовою розвитку важких форм криптоспоридіозу є зрушення імунологічних показників. Криптоспоридіоз також відзначається як опортуністичного захворювання, значно ускладнює протягом основних - вірусних і бактеріальних інфекцій.

В даний час розроблені методи діагностики криптоспоридіозу тварин, проте немає літератури, яка узагальнювала б ці дані і рекомендувала ветеринарним лікарям найбільш доступні і ефективні методи лабораторної діагностики.

Біологія розвитку збудника

Паразитує в кишечнику ссавців Cryptosporidium parvum є гомоксенним паразитом (розвивається без зміни господарів).

У зовнішнє середовище з кишечника хворих тварин збудник виділяється у вигляді инвазионной ооцисти, за будовою нагадує ооцисту широко відомого паразитичного найпростішого - Еймері. Ооциста кріптоспорідіума відрізняється від неї значно дрібнішими розмірами (в середньому - 4-5 мкм), і вільно лежать всередині неї, чи не ув'язненими в спороцисту, 4-ма спорозоитами. Ооцисти кріптоспорідіумов зазвичай округлої форми, мають залишкове тіло.

Інвазійні ооцисти, які виділяються хворим тваринам або носієм, потрапляють в організм здорової тварини аліментарним шляхом. У тонкому відділі кишечника їх оболонка руйнується, звільняючи 4 червоподібний спорозоїта, які впроваджуються в зону між ворсинками епітеліальних клітин. У цитоплазму клітин вони не проникають, подальший розвиток відбувається на поверхні щіткової облямівки епітеліальних клітин (в зоні мікроворсинок) (4). Утворюється так звана паразітофорная вакуоль: криптоспоридии знаходяться в контакті з клітинами, біля основи мікроворсинок; микроворсинки над ними з'єднуються, «склеюються», їх мембрани зливаються, обмежуючи паразита від просвіту кишечника. Сусідні ворсинки стають більш щільними, атрофуються. З боку цитоплазми ураженої клітини формується складчатое освіту - живить органела.

Паразітофорние вакуолі утворюються вже через 24 годин після зараження. Усередині них відбувається безстатеве розмноження збудника - шизогонія (множинне розподіл) трофозоітов (утворених з округлих спорозоїтів, приступили до харчування). Шизогонія відбувається протягом 72 год, генеруються численні шизонти, які осідають на щіткової каймі інших клітин. Після утворення 2-й генерації шизонтів настає гаметогонія - статевий процес. Утворюються чоловічі статеві клітини (мікрогамети), які зливаються з жіночими (макрогамета) в області щіткової облямівки. Утворюється зигота, яка випадає в просвіт кишечника, покривається оболонкою, стаючи власне ооцистами. Ооциста спорулирующих (всередині неї формуються 4 спорозоїта) і виводиться вже инвазионной в зовнішнє середовище. Близько 80% ооцист виділяються з кишечника з фекаліями і мають товсту оболонку. Решта 20% ооцист мають тонку оболонку і залишаються в кишечнику, обумовлюючи аутоінвазіі і підгострий перебіг хвороби (12).

Препатентний період збудника (час, що проходить з моменту зараження до виділення перших ооцист) у телят становить 3-7 діб, патентний (масового виділення ооцист) - 8-12 днів. У перебіг хвороби протягом тонкого кишечника (особливо в області худої і клубової кишки) утворюються великі ділянки атрофії і десквамації епітелію.

Хвороба розвивається найчастіше в ослаблених тварин з імунодефіцитом, а також на фермах, неблагополучних по стрептококозу, ешеріхіозов, вірусних інфекцій (3; 11). Екстенсивність інвазії (ЕІ) телят може досягати 6-68%, летальність - 17-50% (1; 7).

Загострення епізоотичної обстановки по криптоспоридіоз останнім часом пов'язано, ймовірно, з введенням технології утримання, при якій тварини концентруються на невеликій площі, а тваринницькі приміщення експлуатуються з підвищеним навантаженням (9). Сприяє швидкому поширенню хвороби в господарствах виділення з фекаліями хворих телят вже спорулірованних (інвазійних) ооцист, значна стійкість їх у зовнішньому середовищі (зберігають життєздатність до 16 міс при температурних коливаннях, при дезінфекції звичайними засобами), а також висока інтенсивність виділення (в 1г фекалій хворого теляти може міститися понад 1 млн. ооцист) (12).

Заразилися в перші дні життя телята залишаються носіями криптоспоридий до 8-ми місячного віку. Джерелами інвазії іноді можуть служити дорослі корови, обслуговуючий персонал, кішки, собаки, комахи (12). Джерелом зараження є корм, вода, інвентар і т. П. Контаміновані збудниками.

Для знезараження телятників рекомендується застосовувати 10% розчин формаліну або 5% розчин аміаку. які викликають загибель ооцист за 18 год. Також необхідно вести боротьбу з пацюками як з основними переносниками та розповсюджувачами інвазії на фермах.

Патогенез і клінічні ознаки

Кріптоспорідіі локалізуються зазвичай в тонкому відділі кишечника, рідше - в слизовій оболонці шлунка, казуістичності - в трахеї, кон'юнктиви ока. Значні зміни відзначаються в термінальному відділі клубової кишки і в порожній кишці. Там спостерігається атрофія ворсинок, кратероподібної вдавлення епітелію. Уражені ворсинки злипаються між собою, втрачають келихоподібних клітини (1; 12). Як наслідок цього, відбувається порушення всмоктування. Механічне руйнування ворсинок паразитами веде до появи некрозів. Вміст кишечника рідке, з бульбашками газу (13).

На місці прикріплення паразитів відсутні микроворсинки, усмоктувальна поверхня кишечника сильно скорочується, значно зменшується і його абсорбційна спроможність, що є основною причиною діареї. Змінюється активність ферментів, порушується кишкове травлення, відбувається гнильний розпад білка в кишечнику. Розвивається інтоксикація організму вторинного характеру.

Перші ознаки хвороби спостерігають з перших днів життя телят, далі хвороба прогресує, посилюється профузний пронос, пригнічення, відмову від корму, слабкість. Фекалії тварин жовті або біло-сірі, водянисті внаслідок порушення всмоктування, з гнильним запахом - внаслідок порушень ферментного травлення. Часто в них видно прожилки крові і шматочки слизової оболонки. При розвитку хвороби тенезми можуть припинятися, фекалії витікають мимовільно. Температура тіла протягом хвороби зазвичай не підвищена, а при тяжкому перебігу - знижена.

У крові спостерігається еозинофілія, лейкопенія, лімфоцитопенія. зниження загального сироваткового білка і гамма-глобулінів, глюкози (1; 2).

Підгострий перебіг, обумовлене аутоінвазіі тонкостінними ооцистами, які залишаються в кишечнику, носить тривалий характер зі стертими клінічними ознаками і призводить до затримки росту, недобору приростів і в кінцевому рахунку - до зниження продуктивних і репродуктивних якостей тварин (5).

У хворих тварин в ураженому кишечнику спостерігається суцільне або осередкове катаральне запалення слизової оболонки, її набухання і витончення, гіперемія, відкладення фібрину і слизу, десквамація епітелію, крововиливи. На гістологічних препаратах, приготовлених з зрізів тонкого кишечника хворих телят, можна бачити укорочення, сплощення ворсинок і атрофію мікроворсинок, у яких відсутній або сильно скорочений гликокаликс. Цитоплазма ентероцитів вакуолізірована, спостерігається інтра - і екстрацелюлярний набряк, інфільтрація слизового і підслизового шарів кишкової стінки макрофагами і нейтрофілами, діапедезні крововиливи з пошкоджених судин. Кишкові залози зморщені і заповнені клітинним детритом (1; 5).

Брижові лімфовузли збільшені, місцями почервонілі, на розрізі - соковиті. Спостерігається пряма залежність вираженості патологоанатомічних змін від ступеня ураження клітин криптоспоридіями.

Слід підкреслити, що схожі зміни можуть бути викликані і іншими причинами поразки кишечника; патогенез власне криптоспоридіозу мало вивчений (1).

ЛАБОРАТОРНА ДІАГНОСТИКА криптоспоридіоз

Діагноз на криптоспоридіоз встановлюють на підставі лабораторних досліджень фекалій (прижиттєво) і патологічного матеріалу (посмертно) з урахуванням епізоотологічних, клінічних і патологоанатомічних даних.

Для дослідження в лабораторію направляють:

свіжі проби фекалій масою близько 10 г з прямої кишки, взяті від 10-20 підозрюваних в захворюванні тварин, проби досліджують в день відбору;

проби патматеріалу від трупів - зіскрібки і мазки-відбитки з уражених місць кишечника або ділянки тонкого кишечника, які необхідно досліджувати не пізніше 6 годин після загибелі тварини.

Приготування мазка зі свіжих фекалій. На знежирене предметне скло наносять краплю фекалій, розбавляють краплею фізіологічного розчину, розподіляють тонким шаром (без натиску!). Отриманий мазок висушують при кімнатній температурі.

Застосування флотаційних методів. Пробу фекалій масою 3 г поміщають в стакан об'ємом 50 мл, заливають невеликою кількістю насиченого розчину хлориду натрію (400 г на 1 літр гарячої води, щільність розчину 1,18 г / мл) або сульфату цинку (400 г на 1 л води, щільність розчину 1,24 г / мл) або сумішшю Павласека (хлорид цинку - 220 г, хлорид натрію - 210 г, вода - 800 мл). Ретельно розмішують паличкою, додають розчин до країв склянки, фільтрують через сито і відстоюють протягом 15-20 хв. Потім металевою петлею знімають 15-20 крапель з поверхневою плівки, переносять на предметне скло, роблять тонкий мазок і висушують на повітрі.

Застосування центрифугування в поєднанні з флотацією. Пробу фекалій масою 3 г поміщають в стакан ємністю 50 мл, додають 15 мл води, розмішують, фільтрують через металеве сито, переливають в центрифужную пробірку і центрифугують при об / хв протягом 1-2 хв. Надосадову рідину зливають, до осаду додають один з флотаційних розчинів, зазначених вище, перемішують і знову центрифугують при тому ж режимі. Металевою петлею знімають 15-20 крапель з поверхневою плівки, переносять на предметне скло, роблять тонкий мазок і висушують на повітрі.

Фіксація мазків. На висушений мазок наносять кілька крапель етилового (метилового) спирту і фіксують протягом 10-15 хвилин до повного випаровування спирту. Потім мазок забарвлюють одним із таких способів.

Забарвлення мазків за Цілем-Нільсеном. Для приготування карболового фуксину Циля в ступку вносять фуксин основний - 2г, додають 2-3 краплі гліцерину, розтирають, ретельно перемішують при поступовому додаванні спирту етилового 96 ° - 12 мл, карболової кислоти - 5 г і води дистильованої - 100мл. Розчин зливають в склянку з щільною пробкою, поміщають на добу в термостат при температурі 37 ° С і фільтрують через паперовий фільтр.

Зафіксовані мазки забарвлюють протягом 20 хв в розчині карболового фуксину, промивають в проточній воді, злегка висушують і наносять на скло 7-10% розчин сірчаної кислоти на 30-60 секунд для знебарвлення. Потім промивають в проточній воді і дофарбовують мазок 5% розчином малахітового зеленого протягом 1-2 хвилин.

Забарвлення мазків сафранін по Кюстера. Готують окремо 3% розчин сафраніну і 5,6% розчин КОН в дистильованої воді. Перед застосуванням готують робочий розчин: беруть 5 крапель свіжоприготованого розчину сафраніну і змішують з 1,5 мл розчину КОН.

Фіксований мазок забарвлюють робочим розчином сафраніну протягом 5 хв, промивають водою, знебарвлюють 0,5% розчином сірчаної кислоти протягом 15 секунд, промивають водою, дофарбовують 5% розчином малахітового зеленого на 10% етиловому спирті протягом 10-15 секунд, промивають водою , висушують на повітрі.

Забарвлення мазків за Романовським-Гімзою. Робочий розчин фарби готують із розрахунку 1-3 краплі готової фарби на 1 мл води (рН = 7,0-7,2). На один препарат використовують 3-4 мл розведеної фарби.

Фарбують фіксовані мазки протягом 20-30 хв, після чого їх промивають дистильованою водою і висушують.

Оцінка результатів забарвлення. Висушені мазки переглядають під великим збільшенням мікроскопа, з використанням иммерсионного об'єктива.

- за Цілем-Нільсеном - кислотостійкі ооцисти криптоспоридий округлої форми, 4-5 мкм, яскраво-червоного кольору різних відтінків; вони добре помітні на загальному зеленому тлі мазка.

- по Кюстера - ооцисти фарбуються в блідо-рожевий колір.

- за Романовським-Гімзою - округлі ооцисти не фарбується або фарбуються слабо, всередині них по периферії помітні спорозоїти подовженої форми, злегка зігнуті, блідо-блакитного кольору з червоною гранулою.

Оцінка інтенсивності інвазії в середньому по 10 полях зору мікроскопа:

+ - низька (1-3 ооцисти);

++ - середня (до 25 ооцист);

+++ - висока (понад 25 ооцист).

Посмертний діагноз на криптоспоридіоз представляє певні складності: у зв'язку з дрібними розмірами ооцист, їх зовнішньою схожістю на мазках-відбитках з краплями жиру, еритроцитами та ін. А також швидким аутолизом. Обов'язкова умова - недопущення заморожування і відтавання проб патматеріалу. Мазки-відбитки і зіскрібки фіксують етанолом і забарвлюють за Цілем-Нільсеном, потім переглядають під великим збільшенням мікроскопа, з використанням иммерсионного об'єктива (5; 13).

У досліджуваних мазках ооцисти криптоспоридий слід відрізняти від інших збудників, що викликають ентерити молодняка. Ооцисти еймерій в мазках - різної форми, значно більші за криптоспоридий, всередині бувають помітні 4 спороцисти, що містять по 2 спорозоїта. Яйце гельмінта - велике, овальне, кругле або бочонковідниє, з оболонкою складної будови (1).

У зв'язку з досить неспецифічними клінічними проявами ентериту кріптоспорідіозной етіології, його слід відрізняти від ентеритів інфекційної природи, визначати провідну роль збудників в їх виникненні. (20предложен спосіб орієнтовного виявлення провідного збудника ентериту в забарвлених по Граму мазках-відбитках зі слизової оболонки кишечника телят (таблиця 1).

Диференціальна діагностика криптоспоридіозу по мазкам-відбитками зі слизової оболонки кишечника.

Вид в поле зору мікроскопа при дослідженні мазка-відбитка

5. Тимчасові Методичні Вказівки з лабораторних досліджень на криптоспоридіоз тварин (затв. ГУ ветеринарії Україна 9.06.88.) - М. 1988.

8. Пашкин і вікова динаміка криптоспоридіозу телят у тваринницьких господарствах Ленінградської області // Зб. наук. Тр. ЛГВ. - Л. 1989. - № 000. - С. 77-81.

9. Гутий телят // Ветеринарія. - 1989. № 8. - С. 46-48.

10. і ін. Поширення криптоспоридіозу телят у тваринницьких господарствах Ленінградської області // С. Наук. Тр. ЛГВ. - 1989. - № 000. - С.82-85.