темнопольна мікроскопія

Рух бактерій і спірохет можна спостерігати в темнопольному, який відрізняється від звичайного світлового спосо-бом освітлення препарату. У цьому випадку застосовують бічне освітлення, в силу чого виходить зображення светяще-гося об'єкта на темному тлі. Принцип темного поля заснований на тому, що падаючі збоку світлові промені відхиляються щільними частинками (зокрема, мікробами) і останні завдяки цьому представляються ока спостерігача яскраво світяться. Бо-ковое освітлення в мікроскопі можна отримати, замінивши, звичайний освітлювач спеціальним конденсором із затемненням в центрі. Такий конденсор затримує всі центральні промені світла і пропускає лише периферичні (рис.3). Замість спеціального кондом-сміття для темного поля можна користуватися звичайним висвітліть-лем, між двома лінзами якої вставляють гурток чорної бу-маги трохи меншого діаметру, ніж лінза. Працювати треба з сильним джерелом світла (дугового лампою або звичайною лампоч-кою в 200-300 свічок). Техніка досліджень полягає в наступному. На предметне скло наносять краплю матеріалу і обережно накривають покривним склом, щоб не було міхур-ков газу. Потім на поверхню конденсора поміщають краплю води або кедрового масла, і предметне скло з препаратом кладуть на цю краплю.

Препарат розглядають або через сильну суху систему (об'єктив 40), або через іммерсійну систему. В останньому випадку на покривне скло також наносять краплю кедрової олії, а до іммерсіі пригвинчують маленьку муфточку - діа-фрагменти, щоб звузити діаметр просвіту об'єктива.

При мікроскопії цим методом промені, що освітлюють об'єкт, не потрапляють в об'єктив мікроскопа, поле зору залишається темним, а об'єкт на його тлі здається світиться (рис. 4). Ефект темного поля створюється за допомогою спеціального конденсора (параболоїд або кардіоїд) або звичайного конденсора з прикритою гуртком чорного паперу центральною частиною.

Для спостереження в темному полі світло встановлюють і цін-Трір, як для світлого поля, і, замінивши конденсор спеці-альних, додають світло до максимуму, розкривши до відмови діа-фрагменти і включивши реостат освітлювача.

Препарати для дослідження в темному полі повинні бути приготовлені на дуже чистих предметних і покривних стеклах певної товщини: предметні - не більше 1,2 мм, покрив-ні - 0,17 мм. Готують препарат за типом "роздавленою" або "висячої" краплі (рис. 5). Між препаратом і конденсором поміщають іммерсійне масло (краплю його наносять на верхню лінзу конденсора). Після цього, піднімаючи і опускаючи конденсор, домагаються появи в поле зору світлої плями, яке за допомогою спеціальних регулюються-ровочной гвинтів конденсора виводять в середину поля зору. Потім за допомогою потрібного збільшення переходять до спостереження.

Фазово-контрастна і аноптрального мікроскопія

Фазово-контрастний мікроскоп значно підвищує контра-стность об'єктів, проникних для світла, і в медицині ис-користується для вивчення нативних препаратів. За допомогою цього методу можуть бути досліджені без попередньої обробки безбарвні, прозорі об'єкти, деталі, будова яких оп-тично мало різняться між собою.

Пофарбовані препарати частково поглинають світло. Пучок світла, що проходить через такий препарат, втрачає в своїй ін-інтенсивності, тобто зменшується амплітуда світлової хвилі, і це легко вловлюється оком дослідника. Такі препарати контрастні навіть в звичайному мікроскопі і називаються "амплітуд-ними". Препарати, які не поглинають світла, прозорі. Пучок світла, що проходить через такий препарат, не втрачає своєї ін-інтенсивності. Амплітуда світлової хвилі не змінюється, а лише змінюється фаза коливання, що не реєструється чоловіча-ським оком. Такі об'єкти називаються фазовими. До них відно-сятся живі, нефарбовані препарати. Щоб підвищити контра-стность зображення, необхідно перетворити фазові зміни в амплітудні. Це досягається шляхом приміщення в об'єктиви фазової пластинки у формі кільця і ​​застосуванням кільцевої діафрагми. Кожному об'єктиву відповідає своя діафрагма. Зображення цієї діафрагми збігається з кільцем фазового пла-Стінкі відповідного об'єктива. Метод фазових контрастів може бути позитивним і негативним. У першому випадку на світлому тлі поля спостерігається темне зображення об'єкта, а в другому фон темний, а об'єкт світлий. Найкращі результати спостерігаються в разі позитивного контрасту.

Поширення світлових хвиль в прозорих однорідних об'єктах не супроводжується втратою інтенсивності світла. Ме-вується тільки швидкість проходження світлового потоку через об'єкт в порівнянні зі швидкістю поширення світла в навколишньому середовищі. Вона буде більшою або меншою в залежності від того, чи буде показник світлопереломлювання об'єкта відповідно менше або більше, ніж у навколишньому середовищі. Ці зміни, називає-мі інакше фазовими, так як при них змінюються лише фаза ко-лебанія минулого світла, характерні для більшості биоло-ня об'єктів (живих клітин, зрізів тканин і т. П.).

Людське око добре визначає зміни інтенсив-ності світла, що настають при проходженні через пофарбовані (амплітудні) препарати, коли змінюється амплітуда коливань світла. Однак око не здатне сприймати фазові зраді-ня світла. Тому прозорі неконтрастні (фазові) об'єк-екти при звичайному мікроскопічному дослідженні залишаються-видимими.

Для роботи за методом фазового контрасту потрібно, крім звичайного біологічного мікроскопа, мати ще спеціальний пристрій. Установку пристрої роблять у такий обра-зом. Конденсор і об'єктив замінюють фазовими. Фазовий кондом-сор поворотом револьверного диска встановлюють на 0. Це положення відповідає звичайному светопольному конденсором. Потім, помістивши на предметний столик препарат і сфокусувавши його, приступають до налагодження освітлення. При дослідженні мето-дом фазового контрасту основною умовою є оптимальним ная освітленість, яка досягається установкою світла по Кьолеру. Після цього встановлюють револьверний диск на те число, яке відповідає обраному об'єктиву; наприклад, при об'єктиві 40 в віконечку також встановлюють цифру 40. Вийнявши окуляр, на його місце встановлюють допоміжний мікроскоп і налаштовують його на зображення двох кілець (якщо-цевая діафрагма конденсора і фазова пластинка). Центро-вочной пристроєм конденсора домагаються сполучення кілець. Замінивши допоміжний мікроскоп окуляром, можна вироб-дить дослідження препарату.

Метод аноптрального контрасту є удосконаленням методу фазового контрасту. Теоретичні обгрунтування і конструктивні особливості аноптрального пристрої, в основному не відрізняються від звичайної фазово-контрастної установки (рис. 6). Принцип його пристрою полягає в наступному. На верхню поверхню передостанній лінзи иммерсионного об'єктива наноситься кільце з сажі, пропускає лише близько 10% світла, що проходить. У передній фокальній площині кон-денсора поміщається кільцева діафрагма, зображення якої повинно повністю збігатися з кільцем сажі на об'єктиві. Пре-Параті висвітлюється повним конусом променів, що проходять через кільцеву діафрагму конденсора. При відсутності об'єктів (наприклад, мікробів в препараті) в об'єктив потрапляють тільки недіфрагірованние промені, амплітуда яких, після того як вони пройдуть через кільце сажі, зменшиться на 90%. У той же час амплітуда променів, діфрагірованних частинками об'єкта, які пройдуть повз кільця з сажі, не зміниться і тому фон поля буде темний, а частки об'єкта світлими. Пре-майном методу аноптрального мікроскопії є біль-Шая роздільна здатність об'єктивів і можливість виявив-лення мінімальних оптичних різниць щільності в неокра-шенних препаратах. Чим більше оптична щільність об'єкта, тим світліше його зображення. Методика використання устрій-ства не відрізняється від фазово-контрастного. За допомогою аноптрального мікроскопа можна вивчати морфо-логию і локалізацію нуклеоидов (ядерний апарат), спостерігати за змінами морфології бактерій в процесі нормального росту і розмноження.