Темнопольна мікроскопія - студопедія

до лабораторних занять з мікробіології

для студентів фармацевтичних вузів та

За редакцією доктора медичних наук, професора, академіка АНТК України І.Л.Дікого

РОЗДІЛ «МОРФОЛОГІЯ МІКРООРГАНІЗМІВ»

Тема: Види мікроскопії: призначення і принципи застосування

Мета: Ознайомитися з принципами та методами вивчення морфології мікроорганізмів.

Мікроорганізми можна побачити за допомогою оптичного при-бору - мікроскопа. Мікроскоп (від грец. Micros - малий і scopeo - дивлюся) служить для вивчення малих об'єктів, невидимий-мих неозброєним оком. У мікробіології мікроскоп використовується для дослідження як живих, так і вбитих мікробів, в пофарбованому або незабарвленому вигляді. У мікробіологічній практиці, в залежності від цілей об'єктивів дослідження, застосовують різні види мікроскопій: светопольную, фазово-контрастну, аноптрального, люмінесцентну, електронну.

Питання для самопідготовки

1. Види мікроскопії: светопольная, темнопольная, фазово-контрастна, аноптрального, люмінес-процентним, електронна.

2. Пристрій светопольного мікроскопа і правила роботи з ним. Іммерсійна система збільшення.

2. Н.П.Елінов, Н.А.Заікіна, І.П.Соколова. Керів-дство до лабораторних занять з мікробіології. - М. Медицина, 1988. - С. 9-35.

Пристрій светопольного мікроскопа іпорядок роботи з ним

Звичайна светопольная (або світлова) мікроскопія призначена для вивчення пофарбованих мікроскопічних препаратів, які інтенсивно поглинають світло.

На рис. 1 зображений светопольний біологічний мікроскоп. Його механічна частина складається з підстави (або штатива), коробки з мікромеханізм, предметного столика, тубус-держателя, бінокуляр, револьвера з об'єктивами.

У штативі розрізняють нижню частину (або ніжку), і верхню частину (або колонку). До колонці, яка служить ручкою для перенесення мікроскопа, прикріплений рухомий предметний столик, на кото-рий поміщається досліджуваний об'єкт. Він має центрування та за допомогою гвинтів пересуває препарат в двох взаємно перпендикулярних напрямках. Відлік переміщення в обох напрямках може проводитися за шкалами і ноніусом з точністю до 0,1 мм.

До верхньої частини колонки приєднується труба мікроскопа - тубус. Тубус є рухомий трубкою, до якої прикріплюються лінзи, службовці для збільшення досліджуваного об'єкта. Тубус приводиться в рух вгору і вниз двома системами гвинтів: макровінтом і мікрогвинти для тонкої фокусування.

Для грубої наводки служить зубчатка, або кремальера, при-водиться в рух макрометріческім гвинтом. Цим гвинтом користуються при малих збільшеннях, а також при великих збільшеннях для грубої первісної установки. Переміщення ту-буса рукояткою макровінта можливо в межах 50 мм.

Для більш точної установки служить мікрометричний гвинт. На правій рукоятці тонкої фокусування закріплений барабан зі шкалою, розділеної на 50 частин. Ціна одного ділення шкали барабана 0,002 мм. Один оборот барабана відповідає переміщенню тубуса на 0,1 мм. Загальна величина переміщення ту-буса від упору до упору дорівнює 2,2-2,4 мм. Мікрометричний гвинт є однією з найбільш тендітних частин мікроскопа, і поводження з ним вимагає особливої ​​обережності.

Пересуваючи ту-бус за допомогою цих двох гвинтів, його встановлюють так, щоб отримати найбільш ясну мікроскопічну картину; це досягається, коли відстань від розглянутого об'єкта до об'єктива дорівнює фокусній відстані цього об'єктива.

Верхня частина тубусодержатель закінчується голівкою, що служить для кріплення револьвера і тубуса. У верхній частині тубуса розташований окуляр, а до нижньої частини його прикріплений револьвер, в гнізда якого угвинчуючи-ються об'єктиви. Револьвер обертається навколо своєї осі, що дозволяє поставити той чи інший об'єктив при бажанні по-лучити більше чи менше збільшення.

Оптична частина мікроскопа складається з об'єктивів, оку-ляра і освітлювального пристрою.

Освітлювальний пристрій знаходиться під предметним столиком і складається з дзеркала і конденсора з діафрагмою. Дзеркало служить для відображення світлових променів у напрямку до об'єктивним тіву і через нього всередину мікроскопа. Одна сторона дзеркала плоска, інша увігнута. Плоским дзеркалом користуються при денному розсіяному світлі, а увігнутим - при штучному ос-освітленні.

Конденсор представляє собою двоопуклоюлінзу, що прикріплюється знизу предметного столика з таким розрахунком, щоб лінза конденсора розташовувалася під отвором предметного столика. Конденсор служить для збирання (конденсації) пучка світлових променів, що забезпечує найбільшу освітлення досліджуваного предмета.

При мікроскопірованіі з денним світлом конденсор необ-ходимо підняти до рівня предметного столика; при искусст-венном освітленні конденсор опускають до тих пір, поки при ма-лом збільшенні зображення джерела світла не з'явиться в площині препарату. При мікроскопії нефарбованих препаратів конденсор слід також опустити.

Між дзеркалом і конденсором поміщається діафрагма, кото-раю регулює обсяг променів, що падають на об'єктив. Вона складається з сталевих пелюсток і за допомогою важеля може змінювати свій діаметр. Пофарбований-ні препарати слід розглядати при відкритій діафрагмі; при вивченні нефарбованих препаратів необхідно відкрити отвір діафрагми.

Об'єктиви являють собою систему двоопуклих лінз, укладених в металеву оп-Раву. Передня (фронтальна) лінза об'єктива є найголовнішим, що виробляє збільшення. Що лежать за нею лінзи коригують зображення-ня і тому називаються коррекционними.

Ступінь збільшення досліджуваного об'єкта залежить від кри-визна лінзи об'єктива, що використовується. Чим менше кривизна лінзи, тим менше збільшення і, навпаки, чим більше кривизна лінзи, тим більше збільшення. Зазвичай об'єктивним мотиви мікроскопа мають цифрове позначення довжини фокусної відстані, яке залежить від кривизни лінзи: чим більше опукла поверхня лінзи, тим менше фокусна відстань і тим більше отримується збільшен-ня.

Характеристика об'єктива складається з його власного збільшення, фокусної відстані, чисельної апертури. Чим менше фокусна відстань, тим сильніше об'єктив, більше його власне збільшення. На корпусі об'єктива вигравірувані позначення власного збільшення ('8, '20, '40, '90) і чисельна апертура. Чисельна апертура - твір поки-зателя заломлення середовища на синус половини отвір кута - для об'єктива характеризує кут, під яким ще може вхо-дить в об'єктив похилий промінь. Крім цих позначень, на корпусі об'єктивів апохроматов пишеться «апохр» і на іммерсіей-ційних «ОВ» або «МИ» - об'єктив іммерсійний (масляний) або «ВІ» - вод-ва іммерсія.

Об'єктиви бувають двох систем: ахромати і апохромати. Ахромати влаштовані простіше, але мають ряд недоліків, які усунуті в більш складних апохроматичних об'єктивах. При застосуванні об'єктивів апохроматов досягається повна яс-ність зображення і усувається хроматична аберація. Як і останньої особливо важливо при мікроскопії кольорових об'єктів. Всі об'єктиви (ахромати і апохромати) поділяються на сухі і їм-мерсіонние. Якщо між об'єктивом і розглядаються препара-том знаходиться повітря, то подібний об'єктив називається сухим. Якщо ж об'єктив занурений в рідину, що заповнює простір між його фронтальної лінзою і препаратом, то подібний об'єктив називається зануреним, або іммерсійним (immersio - занурюю). При досліджень-ванні мікробів застосовується виключно імерсійна, або по-гружная, система об'єктивів.

Імерсіонні об'єктиви мають перевагу перед сухими. Порівняльний хід світлових променів в сухий і иммерсионной системах представлений на рис. 2. При мікроскопії за допомогою сухої системи світлові промені, йду-щие від дзеркала через конденсор в об'єктив, проходять через неоднорідні середовища, що розрізняються показниками заломлення. Так, з повітря (показник заломлення 1,0) пучок світлових променів потрапляє в скло (показник заломлення 1,5), потім знову в повітря і, нарешті, у фронтальну лінзу об'єктива. При кожному з цих переходів частина променів, заломлюючись на краях різнорідних середовищ, відхиляється в сторону і не попа-дає в об'єктив. В результаті поле зору висвітлюється недос-таточно, що особливо важливо при користуванні сильними збільшувальними систе-мами, де дуже малі фронтальні лінзи. Щоб уникнути цього, об'єктив занурюють в краплю рідини (іммерсійне масло, вода), показник заломлення якої близький до поки-ників заломлення скла. Другу краплю цієї ж рідини на-носять на конденсор. Таким чином, конденсор, рідина, пре-Параті, рідина і об'єктив є єдиною сис-тему, яка не викликає відхилення світлового променя.

Окуляр (від латинського слова oculus - очей) складається з двох плосковипуклих лінз (збираю-щей і очної). Він збільшує зображення, що отримується за допомогою об'єктива, в 7, 10 або 15 разів. Такі прості окуляри зазвичай застосовують з ахроматичними об'єктивами. При роботі з апохромат потрібно використовувати спеціальні, так звані компенсаційні, окуляри. У них лінзи підібрані таким обра-зом, що вони дають хроматичну помилку, зворотний залишковим хроматизму апохромат і тому її компенсує. Слід мати на увазі, що збільшує об'єкт тільки об'єктив, окуляр же збільшується не досліджуваний предмет, а тільки його зображені ження, що отримується в об'єктиві.

Загальне збільшення мікроскопа дорівнює добутку збільшення об'єктива на збільшення окуляра. Так, наприклад, комбінація иммерсионного об'єктива 90 з окуляром 10 дає збільшення об'єкта в 900 разів.

Якість мікроскопа залежить не тільки від збільшення ис-які належать їм об'єкта, а й визначається його роздільною силою. Під останньою слід розуміти то найменша відстань ме-жду двома точками препарату, зображення яких можна від-четліво розрізнити під мікроскопом. Чим менше це расстоя-ня, тим більше роздільна сила.

Роздільна сила біологічного мікроскопа з Іммерсійна-функціональною системою дорівнює 0,2 мкм. Отже, при користуванні та-ким мікроскопом межею видимості є об'єкти розміром не менше 0,2 мкм.

Потрібно пам'ятати, що іммерсійний об'єктив вимагає особливого дбайливого поводження з ним. Опускати цей об'єктив потрібно ос-торожно, щоб не роздавити скло препарату, що спричиняє за собою псування фронтальної лінзи. Занурювати іммерсійний об'єктивним тив в краплю олії на предметному склі треба під контролем очі, спостерігаючи збоку, причому очей повинен перебувати на рівні предметного столика. Після занурення об'єктива в ка-плю масла, дивлячись в окуляр, за допомогою макрометріческого гвинта обережно опускають тубус мікроскопа, поки не знаходять в поле зору контури препарату. Потім за допомогою мікро-метричного гвинта встановлюють точне зображення об'єкта.

Після закінчення микроскопирования піднімають тубус мікро-скопа, а потім знімають препарат; фронтальну лінзу обережно витирають м'якою ганчіркою, іноді змочуючи її спиртом, раз-наведеним водою 1: 1.

Освітлення. При роботі з конденсором Аббе незалежно від джерела світла потрібно поль-тися тільки плоским дзеркалом.

Освітлювальний пристрій (або освітлювальний апарат Аббе) складають дзеркало, ірис-діафрагма і конденсор. Зер-кало, завдяки тому, що його оправа вмонтована в спеці-альної вилці, може обертатися в двох взаємно перпендикуляр-них напрямках. Одна з поверхонь, що відбивають дзеркала плоска, інша увігнута.

Сучасна ірис-діафрагма, скорочуючись по типу зіниці, дозволяє регулювати величину світлового пучка, поступаю-ного в конденсор. Це важливо тому, що світлосила (апертура) конденсора завжди повинна бути трохи менше, ніж у об'єктивним тива.

Конденсор представляє собою систему лінз, вмонтований-них в конічну металеву оправу. Чим більше лінз, тим більше світлосила конденсора. Для отримання чіткого з-браженія необхідно, щоб препарат опинився у фокусі кон-денсора. З цією метою конденсор пересувається в вертикальному напрямку в межах 20 мм.

Хід променів. Пучок світла, відбитий дзеркалом, через діа-фрагменти потрапляє в конденсор. Поламав в його лінзах, промені потрапляють на препарат у вигляді конуса, вершина якого обра-щена до препарату. Пройшовши крізь препарат, промені знову расхо-дяться у вигляді конуса і потрапляють в об'єктив. Поламав в лінзах об'єктива, промені на виході з нього дають збільшене, але зворотне зображення. Це зображення будується променями на деякій відстані від задньої лінзи об'єктива, на рівні діафрагми окуляра, т. Е. У фінальній площині очної лінзи. З окуляра промені проходять в око, і на його сітківці виникає уявне, збільшене, зворотне зображення. Таким об-разом, об'єктив збільшує розглянутий предмет, а оку-ляр збільшує зображення. Отже, здатність мік-роскопія до збільшення є сума збільшень, які забезпечуються об'єктивом і окуляром. Більшість об'єктивів дає найкраще зображення при довжині тубуса 160 мм, а окуляри, як правило, розраховані на відстань 250 мм, що відповідає расстоя-нию нормального ока від Новомосковскемого тексту.

Загальне збільшення мікроскопа (V) може бути визначено з урахуванням цих даних за формулою:

де Fоб - фокусна відстань об'єктива;

Fок - фокусна відстань окуляра.

Гарне освітлення досягається при установці світла по ме-Тодуа Келлера. Для цього встановлюють освітлювач на расстоя-ванні 30-40 см від мікроскопа і, переміщаючи патрон з лампочкою або весь освітлювач, домагаються чіткого зображення нитки на-кала лампи на закритій повністю діафрагму конденсора так, щоб це зображення повністю заповнювало отвір конденсора. Закривши діафрагму освітлювача, відкривають діафрагму кон-денсора і, переміщаючи конденсор, домагаються різкого зображення-ня діафрагми освітлювача в поле зору мікроскопа. За допомогою дзеркала зображення отвору діафрагми встановлюють в центрі поля зору, а діафрагму освітлювача відкривають так, щоб було ос-вещено все видиме поле зору. Розкривати більше діафрагму не потрібно, так як це не посилить освітленості, а лише умень-шитий контрастність за рахунок розсіяного світла.

Загальні правила роботи з мікроскопом. Сучасний мікроскоп - це оптичний прилад, що вимагає суворого дотримання ряду правил при роботі з ним. Вони стосуються поводження з приладом і догляду за ним, а також застосування правильного освітлення, вибору в кожному конкретному випадку найкращого варіанту оптичної системи (окуляр - об'єк-єктів - конденсор) і т. П.

Для захисту від пилу мікроскоп потрібно зберігати під чохлом. Час від часу сле-дует перевіряти чистоту і стан оптики і протирати її, але тільки зовні. Для чищення оптики застосовують волосяну пензлик або м'яку тканину, змочені етиловим спиртом, розведеним водою (1: 1), але ні в якому разі не застосовують бензин або ксилол щоб уникнути розклеювання лінз. Механічні труться протирають ксилолом або бензи-ном, а потім змащують маслом.

Рух бактерій і спірохет можна спостерігати в темнопольному, який відрізняється від звичайного світлового спосо-бом освітлення препарату. У цьому випадку застосовують бічне освітлення, в силу чого виходить зображення светяще-гося об'єкта на темному тлі. Принцип темного поля заснований на тому, що падаючі збоку світлові промені відхиляються щільними частинками (зокрема, мікробами) і останні завдяки цьому представляються ока спостерігача яскраво світяться. Бо-ковое освітлення в мікроскопі можна отримати, замінивши, звичайний освітлювач спеціальним конденсором із затемненням в центрі. Такий конденсор затримує всі центральні промені світла і пропускає лише периферичні (рис.3). Замість спеціального кондом-сміття для темного поля можна користуватися звичайним висвітліть-лем, між двома лінзами якої вставляють гурток чорної бу-маги трохи меншого діаметру, ніж лінза. Працювати треба з сильним джерелом світла (дугового лампою або звичайною лампоч-кою в 200-300 свічок). Техніка досліджень полягає в наступному. На предметне скло наносять краплю матеріалу і обережно накривають покривним склом, щоб не було міхур-ков газу. Потім на поверхню конденсора поміщають краплю води або кедрового масла, і предметне скло з препаратом кладуть на цю краплю.

Препарат розглядають або через сильну суху систему (об'єктив '40), або через іммерсійну систему. В останньому випадку на покривне скло також наносять краплю кедрової олії, а до іммерсіі пригвинчують маленьку муфточку - діа-фрагменти, щоб звузити діаметр просвіту об'єктива.

При мікроскопії цим методом промені, що освітлюють об'єкт, не потрапляють в об'єктив мікроскопа, поле зору залишається темним, а об'єкт на його тлі здається світиться (рис. 4). Ефект темного поля створюється за допомогою спеціального конденсора (параболоїд або кардіоїд) або звичайного конденсора з прикритою гуртком чорного паперу центральною частиною.

Для спостереження в темному полі світло встановлюють і цін-Трір, як для світлого поля, і, замінивши конденсор спеці-альних, додають світло до максимуму, розкривши до відмови діа-фрагменти і включивши реостат освітлювача.

Препарати для дослідження в темному полі повинні бути приготовлені на дуже чистих предметних і покривних стеклах певної товщини: предметні - не більше 1,2 мм, покрив-ні - 0,17 мм. Готують препарат за типом "роздавленою" або "висячої" краплі (рис. 5). Між препаратом і конденсором поміщають іммерсійне масло (краплю його наносять на верхню лінзу конденсора). Після цього, піднімаючи і опускаючи конденсор, домагаються появи в поле зору світлої плями, яке за допомогою спеціальних регулюються-ровочной гвинтів конденсора виводять в середину поля зору. Потім за допомогою потрібного збільшення переходять до спостереження.