Сучасні методи лабораторної діагностики

Вибір лабораторних досліджень

Основу мікробіологічної діагностики інфекційних захворювань складають микроско-пическое, мікробіологічні, біологічні, серологічні та алергологічні методи.

Мікроскопічні методи включають приготування мазків і препаратів для микроскопирования. У більшості випадків результати мікроскопічних досліджень носять Орієнтовна характер (наприклад, визначають ставлення збудників до фарбування), так як мно-Гії мікроорганізми позбавлені морфологічних ітинкторіальних особливостей. Проте мікроскопією матеріалу можна визначити деякі морфологічні ознаки збудників-лей (наявність ядер, джгутиків, внутрішньоклітинних включень і т.д.), а також встановити факт наявності або відсутності мікроорганізмів в надісланих зразках.

Мікробіологічні методи - «золотий стандарт» мікробіологічної діагностики, так як результати мікробіологічних досліджень дозволяють точно встановити факт наяв-чия збудника в досліджуваному матеріалі. Ідентифікацію чистих культур (до виду мікроорганізму) проводять з урахуванням морфологічних, тинкторіальних, культуральних, біохімічес-ких, токсигенних і антигенних властивостей мікроорганізму. Більшість досліджень включає визначення чутливості до антимікробних препаратів у виділеного збудника. Для епідеміологічної оцінки ролі мікроорганізму проводять внутрішньовидову ідентифікацію визначенням фаговаров, биоваров, резістентваров і т.д.

Біологічні методи спрямовані на визначення наявності токсинів збудника в досліджуваному матеріалі і на виявлення збудника (особливо при незначному вихідному содер-жаніі в досліджуваному зразку). Методи включають зараження лабораторних тварин досліджуючи-мим матеріалом з наступним виділенням чистої культури патогена або встановленням факту присутності мікробного токсину та його природи. Моделювання експериментальних інфекцій у чутливих тварин - важливий інструмент вивчення патогенезу заболева-ня і характеру взаємодій всередині системи мікроорганізм- макроорганизм. Для проведе-ня біологічних проб використовують тільки здорових тварин певних маси тіла і віку. Інфекційний матеріал вводять всередину, в дихальні шляхи, внутрішньочеревно, внут-рівенно, внутрішньом'язово, внутрішньошкірно і підшкірно, в передню камеру ока, через отвір трепанації черепа, субокципітально (в більшу цистерну головного мозку). У тварин прижиттєво забирають кров, ексудат з очеревини, після загибелі - кров, шматочки різних органів, СМЖ, ексудат з різних порожнин.

Серологічні методи виявлення специфічних AT і Аг збудника - важливий інстру-мент в діагностиці інфекційних захворювань. Особливу цінність вони мають в тих випадках, коли виділити збудник не представляється можливим. При цьому необхідно виявити по-щення титрів AT, в зв'язку з чим досліджують парні зразки сироватки, взяті в інтервалі 10-20 діб (іноді цей інтервал може бути більш тривалим). AT зазвичай з'являються в крові на 1-2-й тиждень захворювання і циркулюють в організмі відносно довго, що позво-ляет використовувати їх виявлення для ретроспективних епідеміологічних досліджень. Оп-ределение класів Ig чітко характеризує етапи інфекційного процесу, а також може слу-жити непрямим прогностичним критерієм. Особливе значення мають методи виявлення мік-робном Аг. У значних кількостях вони з'являються вже на самих ранніх термінах, що робить їх ідентифікацію важливим інструментом експрес-діагностики інфекційних захворювань, а кількісне їх визначення в динаміці інфекційного процесу служить критерієм ефек-тивності проведеної антимікробної терапії.

Аг багатьох збудників володіють сенсибілізуючої дії, що використовують для діаг-ностікі інфекційних захворювань, а також при проведенні епідеміологічних досліджень-ний. Найбільшого поширення знайшли шкірно-алергічні проби, які включають внутрішньошкірне введення Аг (алергену) з розвитком реакції ГЗТ. Шкірні проби знайшли застосування в діагностиці таких захворювань як сап, мелиоидоз, бруцельоз. Найбільш відома проба Манту, яка використовується як для діагностики туберкульозу, так і для оцінки несприйнятливості організ-ма до збудника.

Основу методу ПЛР становить каталізує ДНК-полімеразою багаторазове освіту копій певної ділянки ДНК. Спочатку проводять відпал - термічний поділ двухнитевой молекули ДНК на окремі ланцюжки. Потім середу охолоджують і вносять праймери (затравки), комплементарні нуклеотидних послідовностей обох ланцюжків. Для запуску реакції застосовують синтетичні праймери - олігонуклеотиди, що складаються з 10-20 нуклеотидів (наприклад, дезоксінуклеотідтріфосфат), які взаємодіють з закінченнями послідовно-вательного і утворюють послідовності в 50-1000 підстав. Потім в середу вносять тер-мостабільную taq-полімерази (за назвою бактерії Thermus aquaticus), що запускає утворення вторинних копій ланцюгів ДНК, після чого утворюються двухнитьові молекули ДНК знову підігрівають. Утворені окремі ланцюжки остуджують, вносять праймери і знову повторюють процедуру підігріву та охолодження; оскільки taq-полімераза термостабильна, то необхідність у її повторному внесенні відсутня. ПЛР дозволяє отримати велику кількість досліджуваного фрагмента ДНК навіть у тому випадку, якщо в розпорядженні дослідника є всього лише одна вихідна молекула геномної ДНК. Ідентифікацію копій ДНК проводять методом електрофорезу. Метод ПЛР лежить також в основі ДНК-ідентифікації особистості, встановлення спорідненості людей, виявлення генів спадкових хвороб і ін.

69. антігенпрезентірующіх клітини: види, роль у формуванні клітинного і гуморального імунної відповіді.

Клітини антігенпрезентірующіх (АПК) - клітини системи мононуклеарних фагоцитів (моноцити, макрофаги, купферовские клітини, клітини Лангерганса, дендритні клітини) і В-лімфоцити, здатні здійснювати протеоліз екзо і ендогенних білкових антигенів, в результаті чого утворюються пептиди. Останні зв'язуються в цитоплазмі клітини з комплементарними ділянками молекул I або II класу, транспортуються до мембрани клітини і експонуються на її поверхні, де розпізнаються Т-хелперами або Т-кілерами за допомогою антигенспецифических рецепторів.

Антігенпредставляющіе клітини (А-субсистема) присутні пре-майново в шкірі, лімфатичних вузлах, селезінці і тимусі. До них відно-сятся макрофаги, дендритні клітини, фолікулярні отростчатие клітини лим-фоузлов і селезінки, клітини Лангерханса, М-клітини в лімфатичних фолікулах травного тракту, епітеліальні клітини вилочкової залозі. Ці клітини захоплюють, переробляють і представляють Аг (епітоп) на своїй поверхні іншим імунокомпетентним клітинам, виробляють ІЛ-11 інші цитокіни, секретують простагландин Е2 (PGE2), гнітючий імп ний відповідь. Фагоцитарну і цитолітичну активність макрофагів посилюючи-ет # 947; -ІФН.

Дендритні клітини походять з кісткового мозку і утворюють популяцію будинок гожівущіх клітин, які запускають і модулюють імунну відповідь. Вкостном мозку їх попередники утворюють субпопуляцію СD34 + -клітин, які здатні диференціюватися в клітини Лангерханса для епітелію і дендритні клітини для внутрішнього середовища. Незрілі і неделяшіеся попередники дендритних клітин заселяють багато тканини і органи. Лн ференціровку дендритних клітин підтримують колоніестімуліруюшій фактор гранулоцитів і макрофагів GM-CSF і ІЛ-3. Дендритні клітини мають зірчасті форму і в стані спокою несуть на поверхні відносний невелика кількість молекул МНС. На відміну від клітин Лангерханса, інтерстиціальні дендритні клітини здатні стимулювати синтез Ig В-лімфоцитами. Все дендритні клітини можуть спочатку надходити в тимус-залежну зону периферичних лімфоїдних органів, де дозрівають в так звані інтердигітуючі клітини.

70. Макрофаги: гистогенез, функціональні характеристики, основні медіатори.

макрофітáги (від грец. # 956; # 945; # 954; # 961; # 972; # 962; - великий, і # 966; # 940; # 947; # 959; # 962; - пожирач (синоніми: гістіоціт-макрофаг, гістофагоціт, макрофагоціт, мегалофаг-пожирач)), полібласти, клітини мезенхимальной природи в тваринному організмі, здатні до активного захоплення і перетравлювання бактерій, залишків загиблих клітин та інших чужорідних або токсичних для організму частинок. Термін «макрофаги» введений Мечниковим.

До макрофагів відносять моноцити крові, гістіоцити сполучної тканини, ендотеліальні клітини капілярів кровотворних органів, купферовские клітини печінки, клітини стінки альвеол легкого (легеневі макрофаги) і стінки очеревини (перитонеальні макрофаги).

Встановлено, що у ссавців попередники макрофагів утворюються в кістковому мозку. Активними фагоцитарних властивостями володіють також клітини ретикулярної тканини кровотворних органів, що об'єднуються з макрофагами в ретикуло-ендотеліальну (макрофагіческой) систему, що виконує в організмі захисну функцію.

Головний тип клітин системи мононуклеарних фагоцитів. Це великі (10 - 24 мкм) довгоживучі клітини з добре розвиненим лізосомальних і мембранним апаратом. На їх поверхні є рецептори до Fc-фрагменту IgGl і IgG3, C3b-фрагменту С, рецепторам В- і Т-лімфоцитів, комплементу, іншим інтерлейкіну і гістаміну.

Фактично моноцит стає макрофагом, коли покидає судинне русло і проникає в тканини.

Залежно від типу тканини виділяють наступні види макрофагів.

· Гістіоцити - макрофаги сполучної тканини; компонент ретикуло-ендотеліальної системи.

· Купферовскіе клітини - інакше ендотеліальні зірчасті клітини печінки.

· Альвеолярні макрофаги - інакше, пилові клітини; розташовані в альвеолах.

· Епітеліоподібні клітини - складові гранульоми.

· Остеокласти - багатоядерні клітини, які беруть участь в резорбції кісткової тканини.

· Мікроглія - ​​клітини центральної нервової системи, руйнують нейрони і поглинають інфекційні агенти.

макрофаги містять численні цитоплазматичні ферменти і можуть бути ідентифіковані в тканинах гистохимическими методами, які виявляють ці ферменти. Деякі ферменти, типу мурамідази (лізоциму) і хімотрипсину, можуть виявлятися методом мічених антитіл (імуногістохімія), при якому використовуються антитіла проти білків ферменту. Такі моноклональні антитіла проти різних CD антигенів широко використовуються для ідентифікації макрофагів.

функції макрофагів включають в себе фагоцитоз, «обробку» антигенів і взаємодія з цитокінами.

· Неімунний фагоцитоз: макрофаги здатні фагоцитировать чужорідні частинки, мікроорганізми і залишки пошкоджених клітин безпосередньо, без виклику імунної відповіді. Однак фагоцитоз мікроорганізмів і їх знищення значно полегшуються при присутності специфічних імуноглобулінів, комплементу і лимфокинов, які виробляються імунологічно активованими T-лімфоцитами.

· Імунний фагоцитоз: макрофаги мають поверхневі рецептори для C3b і Fc-фрагмента імуноглобулінів. Будь-які частинки, які покриті імуноглобуліном або комплементом (опсонізовані), фагоцитируются значно легше, ніж «голі» частинки.

· «Обробка» антигенів: макрофаги «обробляють» антигени і передають їх B- і T-лімфоцитів в необхідній формі; Це клітинна взаємодія включає одночасне розпізнавання лімфоцитами MHC молекул і «оброблених антигенів», що знаходяться на поверхні макрофагів.

· Взаємодія з цитокінами: макрофаги взаємодіють з цитокінами, виробленими T-лімфоцитами для захисту організму проти певних агентів, що ушкоджують. Типовий результат такої взаємодії - формування гранульом. Макрофаги також виробляють цитокіни, включаючи інтерлейкін-l, b-інтерферон і фактори росту T- і B-клітин. Різні взаємодії лімфоцитів і макрофагів в тканинах проявляються морфологічно при хронічному запалення.

Роль макрофагів не обмежується секрецією ІЛ-1. У цих клітинах синтезується ще ряд біологічно активних речовин, кожне з яких робить свій внесок в запалення. До них відносяться: естерази, протеази і антипротеаз; лізосомальні гідролази - коллагеназа, аластаза, лізоцим, # 945; -макроглобуліну; монокіни - ІЛ-1, колонієстимулюючий фактор, фактор, що стимулює зростання фібробластів; антиінфекційні агенти - інтерферон, трансферин, транскобаламіном; компоненти комплементу: С1, С2, СЗ, С4, С5, С6; деривати арахідонової кислоти: простагландин Е2, тромбоксан А2, лейкотрієни.