Серодиагностика і ретроспективна діагностика

Критерієм, що дозволяє судити про персистенції вирулентного вірусу в стаді, являють-ся титри АТ в сироватці крові птахів. Дослідження проводять тільки з парними сироватками, отриманими від одних і тих же птахів. Першу пробу беруть перед вакцинацією (або на початку хвороби), другу - на 15-20-й день, наступні один раз на місяць. Застосовують РГГА, РРГ, ELISA.

Диференціальна діагностика. НБ слід диференціювати від ДБЖ, грипу, ПМВ-2, ІЛТ, колібактеріозу і мікоплазмозу птахів. Для лабораторної діагностики грипу птахів, ІБ і НБ використовують діагностикуми біофабричного виробництва. Диференціація вірусів грипу, які налічують 14 підтипів, і парамиксовирусов, що включають 9 серотипів, можлива тільки в лабораторії.

Лабораторна діагностика класичної чуми свин ?? їй

Класична чума свин ?? їй (КЧС) - висококонтагіозна інфекційна хвороба, що характеризується лихоманкою, ураженням кровоносної та кровотворної систем, крупозним запаленням легенів і крупозно-діфтеріческім запаленням товстого кишечника. Група А за даними МЕБ.

До ВКЧС сприйнятливі домашні свині нд ?? ех порід і вікових груп, особливо чистопородні, а також дикі кабани.

Хвороба реєструється головним чином в Азії, Центральній і Південній Америці, а також в деяких регіонах Європи і Африки.

Вірус чуми свин ?? їй належить до сімейства Flaviviridae, рід Pestivirus. Вірусну природу КЧС встановили в 1908 ᴦ. Швейнітц і Дорсі.

Антигенна варіабельність ВКЧС не доведена. За вірулентності розрізняють А-, В- і С -варіанти вірусу. До групи А входять вірулентні епізоотичних штами, що викликають у свин ?? їй нд ?? ех віку гостро протікає хвороба. Віруси підгрупи В вірулентніші тільки для поросят і при циркуляції в стаді викликають атипову або хронічну чуму. ПодгруппаС - американський слабовірулентнимі шт. 331. Встановлено одностороннє спорідненість між ВКЧС і вірусом діареї ВРХ: АТ до вірусу діареї ВРХ нейтралізують ВКЧС, але АТ до ВКЧС НЕ нейтралізують вірусу діареї. У сироватці крові свин ?? їй-реконвалесцентів виявляють ВНА, ПА і КСА.

Діагноз ставлять на підставі епізоотологічних даних, симптомів хвороби, патологоанатомічних змін і результатів лабораторних досліджень. Епізоотологичеськие і патологоанатомічні дані залежать від сприйнятливості свин ?? їй, вірулентності штаму і комплексу заходів з профілактики КЧС.

У разі якщо в осередку штам вірусу отруйний, поголів'я свине ?? їй не імунне, то хвороба характеризується високою контагіозністю, більшою смертністю, гіпертермією, геморагічними ураженнями шкірного покриву, ознаками ураження органів шлунково-кишкового тракту і центральної нервової системи. Звертають увагу виражений геморагічний діатез в різних органах, мармуровість лімфовузлів, інфаркти сіл ?? езенкі, крововиливи в нирках на тлі їх анемії, катарально-геморагічний гастроентерит, лімфоцитарний енцефаломієліт. При цьому часта вакцинація свин ?? їй проти чуми створює імунний фон, що впливає на симптоми хвороби і характер патоморфологічних змін. При хронічному перебігу характерними изме-нями є вогнищевий дифтеритический наліт (бутони), коричнева екзема, фібринозний плеврит і перикардит, некроз мигдалин. Хронічна хвороба часто протікає на тлі інших інфекцій. Правильний діагноз має бути поставлений тільки лабораторними дослідженнями.

Експрес-методи виявлення вірусу КЧС. Рекомендована диференціація пестівірусов з використанням ДНК-зонда на ВКЧС. Як гібридизаційного зонда використовують комплементарную ДНК (мічену 32 Р) до ділянки гена білка Р125. Для швидко-D виявлення ВКЧС в тканинах за допомогою ПЦР із зразків тканин тварин фенольним будинок виділяють препарати РНК, піддають зворотної транскрипції і амплифицируют ПЛР. Використовувані "гніздові" праймери дозволяють ампліфікувати різні ізоляти ВКЧС. ПЛР має високу чутливість і специфічність і дозволяє диференціювати різні пестівіруси. Запропоновано варіант ПЛР для виявлення ВКЧС з використанням 4-х праймерів для ампліфікації фрагментів гена білка

Е-1. Чутливість методу складає 10 ТЦД50.

Виділ ?? ення вірусу. Для виділ ?? ення вірусу беруть проби крові, шматочки сіл ?? езенкі, мигдалин, лімфовузлів, грудної кістки, нирок і легень від 2-3 тварин в перші 2 год після загибелі або забою хворих в атональному стані. Матеріал відбирають в стерильні флакони, закривають гумовими пробками, флакони обробляють зовні 5% -ним розчином хлораміну або освітленим 20% -ним розчином хлорного вапна, обгортають марлею, змоченою дезинфікуючим розчином, і поміщають в поліетиленовий пакет. Взятий патматеріал поміщають в термос з льодом, опечатують і відправляють з нарочним в лабораторію з супровідним документом. В лабораторії з кожної проби готують 20% -ву суспензію на 0,85% -ному розчині NaCl, яку тричі заморожують і розморожують, центрифугують при 3-4 тис. Хв-1 20-30 хв. Надосадову рідину обробляють антибіотиками 1ч при 37 ° С і використовують для виділ ?? ення вірусу.

Виділ ?? ення вірусу в культурі клітин. Використовують перевивали культуру клітин РК-15, вирощену на скляних пластинках. На кожну пробу матеріалу беруть не менше 8 пробірок, в які вносять по 0,4 мл досліджуваного матеріалу. Адсорбують вірус 2 ч 137 ° С, потім його видаляють, клітки відмивають середовищем і заливають 2 мл підтримуючого середовища з 2% сироватки тел ?? єнка. Для контролю якості культури клітин залишають 10 пробірок незарядженими. Інкубують 24-96 ч. ВКЧС в культурі клітин РК-15 не викликає, в зв'язку з цим індикацію його проводять методом прямої ІФ. Через 24-96 год після інокуляції пластинки з монослоем клітин витягують з пробірок, підсушують на повітрі і 10 хв фіксують в холодному (4 ° С) ацетоні, підсушують на повітрі і поміщають їх клітинами вниз на краплі ФИТЦ-Ig ВКЧС, нанесеного в робочому розведенні на предметні скельця. Препарати витримують у вологій камері 30 хв при 37 ° С, потім промивають в посудині з 0,01 M ФСБ з рН 7,2-7,5 30-40 хв в темному місці, споліскують в дистильованої воді, підсушують на повітрі і укладають в забуферений гліцерин (9 частин гліцерину і 1 частина 0,01 М ФСБ з рН 7,5). Для цього на знежирене предметне скло наносять кап-лю забуферованого гліцерину, поміщають препарат клітинами вниз і заливають краю розплав-ленним парафіном, Переглядають під люмин ?? есцентним мікроскопом.

В інфікованих препаратах, оброблених ФИТЦ-Ig, АГ вірусу виявляють по яскраво-зел ?? еному дифузному світіння цитоплазми уражених клітин, розташованих групами, які називають флюоресцирующими мікробляшкамі. Через 24-48 год в культу-ре клітин РК-15 спостерігають появу мікробляшек. При їх відсутності в першому пасажі проводять 2-й і 3-й пасажі випробуваного матеріалу з подальшим ІФ через 24-96 год.

Індикація та ідентифікація віруса.Гістологіческіе дослідження. Проводять з метою виявлення специфічних изме-нений нервових тканин. Від полеглих або убитих свин ?? їй беруть шматочки півкулі головного мозку, мозочка, рогів Аммона, спинного мозку в різних ділянках. Гістологічні препарати забарвлюють гематоксилін-еозином. У більшості випадків (70-93%) в ЦНС про-наружівают негнійний лімфоцитарний енцефаломієліт, що характеризується периваскулярними лімфоцитарними інфільтратами, осередкової проліферації клітин мікроглії (гліальних вузликів) і дистрофію гангліозньгх клітин. B зрізах, приготованих з лим-фоузлов, серцевого м'яза і печінки, можна виявити присутність ацидофільних внут-ріядерних тел ?? ец-включень, кілька менших, ніж ядерця. У лімфовузлах їх знаходять на 6-12-й день після зараження.

ВКЧС має виражену гематотропізмом щодо кісткового мозку, утримуючи-ного більшу кількість бластних клітин, ніж лімфовузли і сіл ?? езенка. З цієї причини кістковий мозок уражається першим; ингибируются Міелопоетіческіе і ерітропоетіческой клітини і проліферують великі клітини з базофільною цитоплазмою. Поряд з цим виявляють картину глибокого цитолізу і дистрофію лімфопоетіческіх органів.

При підозрі на чуму для уточнення діагнозу кілька важкохворих тварин вбивають і досліджують мазки з кісткового мозку грудної клітини.

Біопроба. З благополучного щодо інфекційних хвороб господарства беруть поросят у віці 2-3 міс масою 20-30 кᴦ. Як матеріал використовують 10% -ну суспензію, приготовану з органів (сіл ?? езенкі, лімфовузлів, кісткового мозку) або крові від загиблих тварин. Суспензію обробляють антибіотиками, витримують не менше 4 год при 4 ° С, центрифугують і нужносадочную рідина використовують для зараження тварин. Трьом по-росятам вводять підшкірно по 1 мл крові або по 2 мл суспензії органів. Двом тваринам досліджуваний матеріал не інокуліруют, містять їх окремо для контролю. Двом порося-там, імунним до ВКЧС, вводять досліджуваний матеріал в тих же дозах з метою діфферен-ціальної діагностики щодо АЧС. За вс ?? ємі тваринами спостерігають 21 день і еже-денно вимірюють температуру тіла.

Діагноз вважають позитивним, в разі якщо 2 з 3-х неімунних поросят хворіють, про-являючи симптоми хвороби, і гинуть, а 2 імунних залишаються здоровими або виявляють незначні і короткочасні (1-4 дн) ознаки хвороби слабкої інтенсивності (підвищення температури тіла не вище 41 ° С). При цьому слід мати на увазі, що при відсутність про-наслідком реакції у сприйнятливих тварин або в разі її недостатньої вираженості, не можна з упевненістю виключити присутність вірусу в досліджуваному матеріалі. Негативна вальний результат зараження повинна бути наслідком або надто малої кількості в ньому вірусу, або слабкою вірулентності останнього. З цієї причини наступним кроком є ​​повторне, через 3-6 тижні після інокуляції досліджуваного матеріалу, зараження (реінфекція) піддослідних свин ?? їй на цей раз вірусом зі свідомо відомою вірулентністю. Відсутність про-ствие у тварин реакції на це зараження свідчить про придбання ними імуно-тета в результаті першої інокуляції (безсимптомного переболевания) і побічно вказує на присутність вірусу в досліджуваному матеріалі. Одночасно з проведенням другої проби заражають додатково двох сприйнятливих поросят (контроль) вірусом, вико-ванним для реинфекции.

Іноді біологічна проба себе не виправдовує або дає неясні результати при ви-справ ?? еніі штамів вірусу, що викликають легке захворювання. Такі штами у інокульованої поросят викликають хронічну хворобу. Справа ускладнюється тим, що штами зі слабкою вірулентністю можуть не володіти імунізують властивостями, а це не позво-ляет уточнити діагноз при використанні додаткового контрольного зараження виру-лентним штамом (реинфекции). При діагностиці захворювання, зумовленого такими штамами можуть знадобиться молоді тварини і додаткові пасажі для підвищення вірулентності.

Запропоновано шкала оцінки вірулентності польових штамів ВКЧС:

- слабовірулентнимі (патогенні лише для поросят-сосунов) НЕ імунізують штами. Поросята-сисуни хворіють в перші дні життя і смертність їх велика, поросята-от'емишей (12-15 кг) реагують тільки в определ ?? енние дні підйомом температури тіла, що не набуваючи імунітету;

- слабовірулентнимі (патогенні для молодих тварин) імунізують штами. У тварин масою 15-20 кг розвивається хронічна хвороба, підсвинки масою 35 кг реаг-ють підйомом температури тіла, триваючим кілька днів. На розтині вияв-ються незначні точкові крововиливи. Тварини набувають імунітету;

- сильно вірулентні штами викликають у тварин масою 30 кг гостре захворювання, смертність 40% і більше. На розтині характерні геморагічні зміни.

Тест модуляції фагоцитарної активності макрофагів. Дефіцит фагоцитарної функції призводить до порушення локальних імунних реакцій з розвитком запальних-них процесів на слизових оболонках. При КЧС відбувається локалізація фагоцитарної функції лейкоцитів: при репродукції вакцинного шт. ЛК-ВНІВВіМ знижується відсоток і індекс фагоцитозу нейтрофілів і макрофагів, а при репродукції вирулентного вірусу шт. Ши-Мінь підвищується відсоток і індекс фагоцитозу нейтрофілів і знижується такої у макрофагів. При КЧС in vivo і in vitro фагоцитарна активність лейкоцитів крові коротко- тимчасово (до 4 діб) знижується при інфікуванні вакцинним штамом і підвищується у макрофагів при інфікуванні вірулентним штамом ВКЧС. Встановлений в інфіці-рова клітинах-мішенях цитопатичної ефект, що виражається в модуляції фагоцит-тарної активності свинячих макрофагів, використовують в діагностиці КЧС.

Читайте також

РН. Діагноз на минулий інфекцію зазвичай ставлять за допомогою РН в культурі кле-ток, визначаючи титри ВНА в сироватках крові реконвалесцентів. Для цього використовують по-постійну дозу вірусу (100-1000 ТЦД50) і дворазові розведення досліджуваної сироватки, яку попередньо. [Читати далі].

Ретроспективна діагностика з метою визначення типу і варіанта ВЯ, що викликав в минулому захворювання тварин, заснована на ідентифікації AT в РПСК, РДП і РРІД, НРІФ, реакції серозащіти на мишенята і РН в культурі клітин. Для достовірного виявлення AT і визначення їх типовий. [Читати далі].

В даний час в лабораторній діагностиці КЧС використовуються три методи вияв-вання специфічних AT до ВКЧС: реакція нейтралізації флюоресцирующих мікробля-шек (РНФБ), реакція непрямої ІФ і непрямий варіант твердофазного ІФА. Найбільш ефективними методами. [Читати далі].