Реакції осадження білків

Відомо, що білки в розчині зберігаються в природному стані за рахунок факторів стійкості, до яких відносяться заряд білкової молекули і гідратне (водна) оболонка навколо неї. Видалення цих факторів призводить до склеювання цих молекул білка і випадання в осад. Осадження білків може бути оборотним і необоротним в залежності від природи використовуваних реактивів.

Оборотне осадження - при цьому процесі під впливом факторів осадження білки випадають в осад, але після припинення дії цих факторів білки знову переходять в розчинний стан і набувають свої нативні властивості. Одним з видів оборотного осадження білків є висолювання.

Необоротне осадження білків пов'язано з глибокими порушеннями структури білків (вторинної та третинної) і втратою ними нативних властивостей. Такі зміни білків можна викликати шляхом кип'ятіння, дією концентрованих розчинів мінеральних і органічних кислот, солями важких металів.

Для висолювання білків використовують солі лужних і лужноземельних металів (найчастіше в практиці використовують сульфат натрію і амонію). Ці солі видаляють водну оболонку (викликають зневоднення) і знімають заряд. Між величиною водної оболонки білкових молекул і концентрацією солей існує пряма залежність: чим менше гидратная оболонка, тим менше потрібно солей. Так, глобуліни, які мають великі і важкі молекули і невелику водну оболонку, випадають в осад при неповному насиченні розчину солями, а альбуміни як більш дрібні молекули, оточені великою водною оболонкою, - при повному насиченні.

Денатурація білка (необоротне осадження) зводиться до руйнування третинної і частково вторинної структури білкової молекули у результаті розриву водневих зв'язків і втрати ним біологічних або нативних властивостей. При незворотних реакціях осадження білки зазнають глибокі зміни і не можуть бути розчинні в первісному розчиннику. До необоротних реакцій відносяться осадження білка солями важких металів, мінеральними і органічними кислотами, алкалоїдними реактивами і осадження при кип'ятінні.

Досвід 1. Висолювання білків сульфатом амонію.

Принцип методу. Висолювання - це додавання до розчину білка нейтральних солей (Na2 SO4. (NH4) 2 SO4). Механізм висолювання полягає у взаємодії аніонів (SO4 2-) і катіонів (Na +. NH4 +) з зарядами білка (групи NH4 + і COO -). В результаті заряд зникає, і відповідно, зникає взаімоотталківанія молекул. Одночасно різко зменшується гидратная оболонка. Все це призводить до «злипання» молекул і осадження.

Насиченим розчином сульфату амонію осідає альбумінової фракція білків, напівнасичення розчином - глобулінового фракція.

Суть реакції полягає в дегідратації молекул білка.

Порядок виконання роботи.

У пробірку наливають 30 крапель нерозведеним яєчного білка і додають рівну кількість насиченого розчину сульфату амонію. Вміст пробірки перемішують. При цьому осідає альбумінової фракція білків.

Отримують напівнасичення розчин сульфату амонію і також змішують (1: 1) з яєчним білком, при цьому глобулінового фракція осідає, а білковий залишається в розчині. Останню фільтрують, потім змішують з порошком сульфату амонію до тих пір, поки не припиниться розчинення солі, при цьому випадає осад - альбуміни.

До утворився опадам (глобулінів і альбумінів) додають воду і спостерігають їх розчинення. Це доводить, що висолювання - процес оборотний.

Оформлення досвіду: отримані результати досвіду записати в зошит і зробити висновок.

Досвід 2. Висолювання білків хлоридом натрію і сульфатом магнію.

Принцип методу. Для висолювання білків з розчинів застосовуються хлорид натрію, сульфат натрію, ацетат натрію, сульфат магнію, ацетат калію, хлорид кальцію, нітрат кальцію і сульфат амонію. Деякі з перерахованих солей висолюють білки не тільки при насиченні ними розчину; певні білки висаліваются і при досить низьких концентраціях солей. До таких солей відноситься сульфат амонію. Умови, при яких відбувається осадження сульфатом амонію, настільки характерні для окремих білків (за рідкісними винятками), що це властивість білків можна порівняти з розчинністю, що характеризує кристалічні речовини.

Білки складаються з амінокислот і тому мають амфотерними властивостями. При розчиненні білків у воді іон водню, що з'являється в результаті дисоціації карбоксильної групи, приєднується до аміногрупи. Тому білкові молекули несуть як позитивні, так і негативні заряди. Величина заряду визначається кількістю йоногенних груп. При певному значенні рН сумарний електричний заряд молекули білка стає рівним нулю. Таке значення рН називається ізоелектричної точкою (рj). У ізоелектричної точці розчини білків мають мінімальну стійкість, оскільки вони позбавлені основного стабілізуючого фактора - заряду і тому легко випадають в осад. Визначити ізоелектричної точки білка можна, визначивши рН, при якому розчин білка має найбільшу помутніння. У більшості білків ізоелектрична точка лежить в слабокислою середовищі.

Осадження білків NaCl і MgSO4 - Хлорид натрію і сульфат магнію на відміну від сульфату амонію осаджують глобуліни з насиченого розчину. У ізоелектричної точці глобуліни цими ж солями осідають при більш низькій концентрації.

Порядок виконання роботи.

У 2 пробірки наливають по 5 мл 1% розчину білка, додають при перемішуванні до повного насичення (коли частина кристалів залишається нерозчинених, незважаючи на збовтування) в одну пробірку тонко подрібненого хлориду натрію, в іншу - сульфату магнію. Через кілька хвилин в двох пробірках з'являється осад глобулінів. Опади фільтрують і до фільтрату додають кілька крапель розведеної оцтової кислоти (СН3 СООН) - в слабокислою середовищі випадають альбуміни. оскільки рН розчину альбуміну наблизиться до ізоелектричної точці.

У водному розчині білків їх частки є зарядженими і сильно гідратованих, що обумовлює стійкість білкових розчинів. Але при високій концентрації солей, іони яких теж сильно гідратованих, відбувається руйнування водних оболонок білкових молекул і знімається заряд з білкової молекули адсорбуються на ній іонами солі.

В результаті цих двох процесів білкові розчини втрачають стійкість, частки білка злипаються один з одним, укрупнюються і, нарешті, випадає осад.

Оформлення досвіду: отримані результати досвіду записати в зошит і зробити висновок.

Досвід 3. Згортання білків при нагріванні.

Принцип методу. Випадання білків в осад при нагріванні характерно майже для всіх білків (виняток становить желатину, що не згортається при нагріванні). Особливо легко і більш повно відбувається осадження білка в слабокислою середовищі, поблизу від ізоелектричної точки. У нейтральній і сильнокислой середовищах осадження білків йде значно гірше, а в лужному середовищі зовсім не спостерігається.

У лужному середовищі знижується дисоціація білка по радикалам діамінокіслот, молекули його набувають негативний заряд, внаслідок чого залишаються в розчині навіть при нагріванні до кипіння.

Додавання до розчину білка нейтральних солей (NaCl) полегшує і прискорює згортання білків при кип'ятінні внаслідок наступаючого дегідратірованія білкових частинок.

Порядок виконання роботи.

У 5 пробірок наливають по 2 мл. білка: першу пробірку нагрівають, осад з'являється ще до того, як рідина закипить. У другу пробірку додають 1 краплю 1% -ного розчину оцтової кислоти (СН3 СООН) і нагрівають. Пластівчастий осад білка випадає швидше і повніше, ніж в першій пробірці внаслідок того, що при підкисленні рН розчину наблизиться до ізоелектричної точці білка (заряд білка = 0). У третю пробірку додають 0,5 мл. 10% -ної оцтової кислоти (СН3 СООН) і нагрівають. Осаду не утворюється навіть при кипінні. У четверту пробірку додають 0,5 мл. 10% -ної оцтової кислоти (СН3 СООН) і кілька крапель насиченого розчину хлориду натрію і нагрівають. Осад є. У п'яту пробірку додають 0,5 мл. 10% розчину лугу і нагрівають. Осад не утворюється навіть при кип'ятінні. Оформлення роботи.

Результати досвіду і висновки записують в таблицю.

Дослід 4. Осадження білків солями важких металів.

Принцип методу. Осадження білків солями важких металів на відміну від висолювання відбувається при невеликих концентраціях солей. Білки при взаємодії з солями важких металів (свинцю, міді, срібла, ртуті та ін.) Адсорбують їх, утворюючи солеобразние і комплексні сполуки, розчинні в надлишку цих солей (за винятком солей AgNO3, HgCl2), але нерозчинні у воді. Розчинення осаду в надлишку солей називається адсорбційною пептизацією. Дане явище відбувається внаслідок виникнення однойменного позитивного заряду на частинках білка. Якщо при розведенні осад не розчиняється, значить, реакція практично необоротна. Іони металів, здатні утворювати нерозчинні сполуки з білками, для нас є токсичними.

Таким чином, солі важких металів: Hg, Ag, Cu, Pb і т.д. викликають необоротне осадження білків, утворюючи з ними нерозчинні компоненти.

Однак при надлишку деяких солей спостерігається розчинення спочатку утвореного осаду. Це пов'язано з накопиченням іонів металу на поверхні денатурованого білка і появою позитивного заряду на білковій молекулі.

Здатність білка міцно зв'язувати іони важкого металу у вигляді нерозчинних опадів у воді використовується як протиотруту при отруєнні солями ртуті, міді, свинцю і ін. Відразу після отруєння зазвичай застосовують білки молока або яєць, поки ще ці солі знаходяться в шлунку і не встигли всмоктатися. Слідом за дачею білка у хворого викликають блювоту, щоб видалити отруту з організму.

Позитивно заряджені іони важких металів (катіони) утворюють міцні зв'язки з негативно зарядженими карбоксил-аніонами R-груп білка і часто викликають розриви іонних зв'язків. Вони також знижують електричну поляризацію білка, зменшуючи його розчинність. Внаслідок цього знаходиться в розчині білок випадає в осад.

Порядок виконання роботи.

У 2 пробірки наливають по 1 мл. розчину білка і повільно по краплях при струшуванні додають в одну 2-3 краплі розчину сульфату міді, в іншу ацетату свинцю. В обох пробірках випадає пластівчастий осад внаслідок освіти малорастворимого солеобразний з'єднання блакитного (з СuSO4) і білого (з Pb (СН3 СООН) 2) кольору.

Оформлення досвіду: отримані результати досвіду записати в зошит і зробити висновок.