Матриці для секвенування ДНК за Сенгер

Отримання одноцепочечной матриці ДНК

набуває підготовка молекул ДНК для здійснення цього процесу. Так, якщо для методу секвенування ДНК хімічної деградацією було необхідна наявність одно- або двуцепочечной фрагмента, що несе на одному (гомогенному) зі своїх кінців єдину мітку, то для секвенування ферментативним методом необхідна наявність немічених матриці ДНК і при цьому бажано одноцепочечной. Хоча, справедливості заради, слід зазначити, що матриця ДНК, що несе якусь мітку (включаючи і радіоактивну), в більшості випадків не зробить помітного впливу на заключний радіоавтограф через велику різницю в розмірах самої матриці і знову синтезованої в умовах термінації ланцюга ДНК . Що стосується матриці ДНК, один з кінців якої несе мітку у вигляді молекули біотину, то в цьому випадку можлива її сорбція на твердій фазі, наприклад, на магнітних частинках з стрептавідином і проведення так званого твердофазного секвенування. При цьому виходу біотінілірованние мітки в заключний розчин терминирующего суміші, що містить комплементарную ланцюг ДНК, мічену вже якось по-іншому і призначену для нанесення на секвеніруют гель, навіть не відбудеться.

Повертаючись до підготовки самих матриць, треба сказати, що з огляду на певних труднощів отримання одноланцюгових фрагментів ДНК з дволанцюгових, перші успіхи в ферментативном секвеніруют-вання були досягнуті з природними одноланцюжковий ДНК, такими як бактеріофаги фХ17 і fl [Sanger et al. 1977a; 1973]. Значні зусилля, які доводилося прикладати експериментаторам для отримання одноланцюгових матриць ДНК, придатних для секвенування ферментативним методом, перший час стримували широке поширення цього методу, оскільки час, що витрачається на їх отримання, було основною складовою всього процесу. Так, в ранніх експериментах з секвенування ДНК пропонувалося клонування представляє інтерес фрагмента в бактеріофаги лямбда з подальшим поділом ланцюгів [Davies, 1982] шляхом вельми тривалого ультрацентрифугирования в градієнті щільності хлористого цезію з полі (U, G), відомого досить давно [Szybalski et al. 1971]. Іншим способом отримання матриць для секвенування, також заснованому на розподілі ланцюгів, але вже хроматографією, був шлях клонування фрагментів ДНК в спеціальному векторі рКН47, сконструйованому на основі плазміди pBR322, і що містить полі (dA): полі (dT) двобічний фрагмент протяжністю близько 100 пн [Hayashi, 1980]. Це дозволяло після денатурації плазмідної ДНК здійснювати досить ефективне розділення кіл клонованої вставки разом з векторними послідовностями, одна з яких несла полі (dA) -, а інша - полі (dT) -участкі на колонках з оліго (dT) - і оліго ( dA) -целлюлозамі відповідно.

Ферментативне приготування одноцепочечной ДНК, придатної для секвенування, досить успішно здійснювалося за допомогою екзонуклеаза III [Smith, 1979]. В цьому випадку фрагмент ДНК розщеплюється однією або двома відповідними рестрикційний ендонуклеаза і в результаті його подальшої обробки екзонуклеаза III відбувалося одночасне розщеплення обох ланцюгів ДНК в напрямку 3 '→ 5' і освіту або двох одноланцюгових фрагментів, які не розщеплюються далі екзонуклеаза III, або структур з рештою двуцепочечной ділянкою (у разі неповного розщеплення). Оскільки екзонуклеаза Ш отщепляет різні нуклеотідмонофосфати з неоднаковою швидкістю [Linxweiler, Horz, 1982], то при повному гідролізі деякого фрагмента ДНК утворюються, як правило, трохи відрізняються між собою за розміром одноцепочечниє субфрагмент, які становлять близько половини вихідного фрагмента ДНК кожен.

Дуже зручним виявилося отримання одноланцюгових матриць ДНК після їх клонування в векторах на основі нитевидного фага М13 [Messing et al. 1981], чому присвячена величезна кількість оригінальних статей і оглядів [Sanger et al. 1980; Davies, 1982; Bankier, Barrell, 1983, 1988; Messing, Bankier, 1988]. Даний підхід зробив практично непотрібними методи, коротко описані вище, і завдяки своїй простоті різко збільшив доступність, отже, і популярність методу ферментативного секвенування ДНК з дідезоксітер-мінаторамі.

Біологія одноланцюжкові нитевидного фага f1 така, що в своєму життєвому циклі він проходить репликативную двуцепочечную стадію і виділені на цьому етапі його кільцеві молекули використовуються в якості векторів, подібно плазмідних. Найбільшого поширення набула ціла серія фагів векторів М13тр, сконструйованих Мессингом і співавт. [Messing et al. 1981; Messing, Vieira, 1982; Vieira, Messing, 1982; Messing, 1983; Norrander et al. 1983; Yanisch-Perron et al. 1985].

Незважаючи на те, що за допомогою фагів або фагмідних векторів отримання одноланцюгових молекул ДНК не представляло особливих проблем, бажання не витрачати на очистку одноцепочечной ДНК від міцно пов'язаних фагових білків змушувало дослідників розробляти підходи до секвенированию дволанцюгових молекул ДНК, не зупиняючись навіть перед фактом, що якість одержуваних результатів при секвенування двуцепочечной ДНК завжди свідомо гірше, ніж одноцепочечной. (Тут поняття "якість" секвенування і "кількість" певних при цьому нуклеотидів дуже тісно пов'язані, оскільки при більш високій якості смуг на радіоавтографія секвеніруют гелю "прочитати" можна буде набагато більша їх кількість.) Так, не дивлячись на потенційно гірші результати, велика число робіт присвячено опису різних підходів щодо підготовки дволанцюгових матриць ДНК, придатних для ферментативного секвенування дідезоксі-методом. Такий, здавалося б, нерозумний підхід пояснюється підвищенням загальної продуктивності всього процесу секвенування ДНК за рахунок економії часу як на очистку одноланцюгових матриць ДНК, так і на проведення необхідного переклонірованія вставки в спеціальний фагів або фагмідний вектор.

З відкриттям процесу виборчої ампліфікації будь-якого фрагмента ДНК за допомогою ПЛР та подальшого розвитку цього методу з'явилася можливість спеціально готувати двуцепочечние матриці для секвенування ДНК ферментативним методом. Причому, вдаючись до деяких хитрощів, є можливість отримувати матриці ДНК, або збагачені по одного ланцюга, або містять тільки один ланцюг.

Отримання одноцепочечной матриці ДНК >>>>