Ферменти як біологічні каталізатори

Глибинний метод виробництва ферментів

Ферменти (ензими) - це високоспецифічні білки, що виконують функції біологічних каталізаторів. Каталізатор - це речовина, яка прискорює хімічну реакцію, але саме в ході цієї реакції не витрачається.

Підвищення середнього енергетичного рівня молекул (підвищення температури, тиску та інших параметрів середовища, яке використовують на хімічних заводах і фабриках) неможливо для живих організмів, які нормально функціонують тільки при постійних значеннях температури, тиску та інших параметрів. Неможливий і інший шлях - зменшення енергії активації шляхом зниження енергетичного рівня реакції, оскільки ця величина є постійною характеристикою даної реакції. Тому, тільки явище каталізу (застосування каталізаторів) може забезпечити прискорення хімічних реакцій в живих організмах.

Загальні властивості каталізаторів:

1. Каталізатори самі не викликають хімічну реакцію, а тільки прискорюють реакцію, яка протікає і без них.

2. Не впливають на енергетичний підсумок реакції.

3. У оборотних реакціях каталізатори прискорюють як пряму, так і зворотну реакцію, причому в однаковій мірі, з чого випливає, що каталізатори:

а) не впливають на спрямованість оборотної реакції, яка визначається тільки співвідношенням концентрацій вихідних речовин (субстратів) і кінцевих продуктів;

б) не впливають на стан рівноваги оборотної реакції, а тільки прискорюють його досягнення.

Ферменти володіють всіма загальними властивостями звичайних каталізаторів. Але, в порівнянні зі звичайними каталізаторами, все ферменти є білками. Тому вони мають особливості, що відрізняють їх від звичайних каталізаторів. Ці особливості ферментів, як біологічних каталізаторів, іноді називають загальними властивостями ферментів. До них відносяться:

1. Висока ефективність дії. Ферменти можуть прискорювати реакцію в 108 -1012 раз;

2. Висока вибірковість ферментів до субстратів (Субстратна специфічність) і до типу каталізуються реакції (специфічність дії);

3. Висока чутливість ферментів до неспецифічним фізико-хімічних факторів середовища - температурі, рН, іонної силі розчину і т.д .;

4. Висока чутливість до хімічних реагентів;

5. Висока і виборча чутливість до фізико-хімічних впливів тих чи інших хімічних речовин, які завдяки цьому можуть взаємодіяти з ферментом, покращуючи або ускладнюючи його роботу.

фермент каталізатор амінокислотний ензимотерапія

Давно з'ясовано, що всі ферменти є білками і мають всі властивості білків. Тому подібно білкам ферменти діляться на прості і складні.

Прості ферменти складаються тільки з амінокислот - наприклад, пепсин, трипсин, лізоцим.

Складні ферменти (холоферменту) мають в своєму складі білкову частину, що складається з амінокислот - апофермент, і небілкової частина - кофактор. Кофактор, в свою чергу, може називатися коферментом або простетичної групою. Прикладом можуть бути сукцинатдегідрогеназа (містить ФАД), амінотрансферази (містять піридоксальфосфат), пероксидаза (містить гем). Для здійснення каталізу необхідний повноцінний комплекс апобелков і кофактора, окремо каталіз вони здійснити не можуть.

Як багато білків, ферменти можуть бути мономерами, тобто складаються з однієї субодиниці, і полімерами, що складаються з декількох субодиниць.

У складі ферменту виділяють області, які виконують різну функцію:

1. Активний центр - комбінація амінокислотних залишків (зазвичай 12-16), що забезпечує безпосереднє зв'язування з молекулою субстрату і здійснює каталіз. Амінокислотні радикали в активному центрі можуть перебувати в будь-якому поєднанні, при цьому поруч розташовуються амінокислоти, значно віддалені один від одного в лінійній ланцюга.

У ферментів, що мають в своєму складі кілька мономерів, може бути кілька активних центрів по числу субодиниць. Також дві і більше субодиниці можуть формувати один активний центр.

У складних ферментів в активному центрі обов'язково розташовані функціональні групи кофактора.

У свою чергу в активному центрі виділяють дві ділянки:

- якірний (контактний, що зв'язує) - відповідає за зв'язування і орієнтацію субстрату в активному центрі,

- каталітичний - безпосередньо відповідає за здійснення реакції.

2. аллостеріческого центр - центр регуляції активності ферменту, який просторово відділений від активного центру і є не у всіх ферментів. Зв'язування з аллостерическим центром будь-якої молекули (званої активатором або інгібітором, а також ефектором, модулятором, регулятором) викликає зміна конфігурації білка-ферменту і, як наслідок, швидкості ферментативної реакції. В якості такого регулятора може виступати продукт даної або однієї з наступних реакцій, субстрат реакції або іншу речовину аллостеріческого ферменти є полімерними білками, активний і регуляторний центри знаходяться в різних субодиниць.

Розрізняють два основних види специфічності ферментів: субстратне специфічність і специфічність дії.

Субстратна специфічність - це здатність ферменту каталізувати перетворення тільки одного певного субстрату або ж групи подібних за будовою субстратів. Визначається структурою адсорбционного ділянки активного центру ферменту.

Розрізняють 3 типи субстратної специфічності:

1) Абсолютна Субстратна специфічність - це здатність ферменту каталізувати перетворення тільки одного, чітко визначеного субстрату.

2) Відносна Субстратна специфічність - здатність ферменту каталізувати перетворення кількох, подібних за будовою, субстратів.

3) стереоспеціфічность - здатність ферменту каталізувати перетворення певних стереоизомеров.

Наприклад, фермент оксидаза L-амінокислот здатний окислювати всі амінокислоти, але які відносяться тільки до L-ряду. Таким чином, цей фермент має відносну субстратной специфічністю і стереоспеціфічность одночасно.

Специфічність дії - це здатність ферменту каталізувати тільки певний тип хімічної реакції.

Відповідно до специфічністю дії все ферменти діляться на 6 класів. Класи ферментів позначаються латинськими цифрами. Назва кожного класу ферментів відповідає цій цифрі.

I клас - Оксидоредуктази.

До даного класу відносяться ферменти, що каталізують окислювально-відновні реакції. При окисленні може відбуватися або відібрання водню від окисляемого речовини, або приєднання кисню до окисляемому речовини. Залежно від способу окислення розрізняють наступні підкласи оксидоредуктаз:

1) Дегідрогенази. Каталізують реакції, при яких відбувається відібрання водню від окисляемого речовини. приклад:

2) оксигенази. Ферменти цього підкласу каталізують включення кисню в окислюються речовина.

a) монооксигенази - включають один атом кисню в окислюються речовина.

б) диоксигеназа - включають 2 атома кисню в окислюються речовина. Часто це супроводжується розривом циклічної структури. За місцем розриву зв'язку (на малюнку позначено стрілкою) приєднуються атоми кисню.

II клас - Трансферази

Каталізують реакції перенесення хімічних груп з молекули однієї речовини на молекулу іншої речовини.

III клас - Гідролази

Каталізують реакції руйнування хімічних зв'язків за участю води.

IV клас - Ліази

Каталізують реакції руйнування хімічних зв'язків без участі води.

V клас - Ізомерази

Каталізують реакції ізомерних перетворень.

VI клас - Лігази

Каталізують реакції синтезу.

Ферменти - це множинні форми одного і того ж ферменту. Ферменти каталізують одну і ту ж реакцію, але відрізняються за амінокислотним складом і деяким фізико-хімічними властивостями (молекулярної масі, електрофоретичної рухливості і ін.). Наприклад, фермент лактатдегидрогеназа (ЛДГ) існує в п'яти формах: ЛДГ, ЛДГ2, ЛДГ3, ЛДГ4, ЛДГ5.

Кожна тканина має певний ізоферментний спектр ЛДГ: в серцевому м'язі - ЛДГ1,2; в печінці, скелетних м'язах - ЛДГ4,5.

Яка доцільність синтезу ферменту в декількох молекулярних формах? У тканинах з переважно аеробним обміном речовин (серцевий м'яз), переважають форми ЛДГ1, 2, які забезпечують тканини великою кількістю енергії. У тканинах з переважно анаеробним обміном речовин (печінка, скелетні м'язи) переважають ЛДГ4,5, що призводить до утворення молочної кислоти і двох молекул АТФ.

Визначення рівня активності ізоферментів в сироватці крові має важливе значення в діагностиці захворювань. наприклад, підвищення активності ЛДГ1,2 спостерігається при інфаркті міокарда; ЛДГ4,5 - при захворюваннях печінки (гепатит, цироз).

Ферментні препарати широко використовують в медицині. Ферменти в медичній практиці знаходять застосування в якості діагностичних (ензімодіагностіка) і терапевтичних (ензимотерапія) коштів.

Ферменти використовують в якості специфічних реактивів для визначення ряду речовин. Так, глюкозооксидазу застосовують для кількісного визначення глюкози в сечі і крові. Фермент уреазу використовують для визначення вмісту кількості сечовини в крові і сечі. За допомогою різних дегідрогеназ виявляють відповідні субстрати, наприклад піруват, лактат, етиловий спирт і ін.

Ензимодіагностика - полягає в постановці діагнозу захворювання (або синдрому) на основі визначення активності ферментів в біологічних рідинах людини. Принципи ензимодіагностики засновані на наступних позиціях:

- при пошкодженні клітин в крові або інших біологічних рідинах (наприклад, в сечі) збільшується концентрація внутрішньоклітинних ферментів пошкоджених клітин;

- кількість вивільняється ферменту досить для його виявлення;

- активність ферментів в біологічних рідинах, які виявляються при пошкодженні клітин, стабільна протягом досить тривалого часу І відрізняється від нормальних значень;

- ряд ферментів має переважну або абсолютну локалізацію в певних органах (органоспецифичность);

- існують відмінності у внутрішньоклітинної локалізації ряду ферментів.

Використання ферментів в якості терапевтичних засобів має багато обмежень внаслідок їх високої імуногенності. Проте, ензимотерапію активно розвивають в наступних напрямках:

- замісна терапія - використання ферментів в разі їх недостатності;

- елементи комплексної терапії - застосування ферментів в поєднанні з іншого терапією.

Замісна ензимотерапія ефективна при шлунково-кишкових захворюваннях, пов'язаних з недостатністю секреції травних соків. Наприклад, пепсин використовують при ахілії, гіпо- і анацидних гастритах. Дефіцит панкреатичних ферментів також в значній мірі може бути компенсований прийомом всередину препаратів, що містять основні ферменти підшлункової залози (фестал, ензістал, мезим-форте та ін.).

В якості додаткових терапевтичних засобів ферменти використовують при ряді захворювань. Протеолітичні ферменти (трипсин, хімотрипсин) застосовують при місцевому впливі для обробки гнійних ран з метою розщеплення білків загиблих клітин, для видалення згустків крові або вузьких секретів при запальних захворюваннях дихальних шляхів. Ферментні препарати рибонуклеазу і дезоксирибонуклеазу використовують в якості противірусних препаратів при лікуванні аденовірусних кон'юнктивітів, герпетичних кератитів.

Ферментні препарати стали широко застосовувати при тромбозах і тромбоемболіях. З цією метою використовують препарати фибринолизина, Стрептоліаза, стрептодекази, урокінази.

Глибинний метод виробництва ферментів

В цьому випадку мікроорганізми вирощуються в рідкому поживному середовищі. Технічно більш досконалий, ніж поверхневий, так як легко піддається автоматизації і механізації. Концентрація ферменту в середовищі при глибинному культивуванні звичайно значно нижче, ніж у водних екстрактах поверхневої культури. Це викликає необхідність попереднього концентрування фільтрату перед його виділенням.

При глибинному культивуванні продуцентів ферментів виділяють, як і в будь-якому біотехнологічному процесі, 5 етапів.

1. Приготування поживних середовищ залежить від складу компонентів.

Деякі попередньо подрібнюють, відварюють або гидролитически розщеплюють. Готові до розчинення компоненти подають при постійному помішуванні в ємність для приготування середовища в певній послідовності. Стерилізацію середовища проводять або шляхом мікрофільтрації за допомогою напівпроникних мембран, або за допомогою високих температур. Час обробки в цьому випадку залежить як від інтенсивності фактора, так і від рівня обсіменіння об'єкта. Стерилізуються також всі комунікації і апарати. Повітря очищається до і після аерування. До - тому що містить частинки пилу органічної і неорганічної природи, після - так як несе клітини продуцента.

2. Отримання засевной матеріалу.

Для засіву живильного середовища матеріал готують також глибинним методом. Вид його залежить від продуцента: для грибів це міцеліальних вегетативна маса, для бактерій - молода зростаюча культура на початковій стадії спороутворення. Отримання посівного матеріалу полягає в збільшенні маси продуцента в 3-4 стадії. Обсяг посівного матеріалу залежить від фізіологічних особливостей продуцента. Якщо продуцент розмножується тільки вегетативно, він різко зростає (до 5-20%). Якщо ж відбувається рясне спороношення - скорочується до 1%.

3. Виробниче культивування.

Біосинтез ферментів в глибинній культурі протікає протягом 2-4 діб при безперервному подаванні повітря і перемішуванні. Висока концентрація поживних речовин на перших етапах можуть гальмувати зростання біомаси продуцента, тому часто свіжому середовищі або деякі її компоненти вводяться в ферментер на стадії активного зростання. Температурний оптимум знаходиться в інтервалі 22-32оС. У сучасних технологічних процесах ведеться безперервне автоматичне визначення вмісту в середовищі вуглеводів, кількості утворилися метаболітів і концентрації клітин. Дані надходять в комп'ютер, який визначає стратегію корекції процесу і автоматично регулює його. Цим досягається максимальна продуктивність і найкращу якість продуктів.

У міцелії трёхсуточной культури зазвичай залишається не більше 15% ферментів. Решта виділяються в навколишнє клітини рідку середу. В цьому випадку препарати ферментів виділяють з фільтратів після відділення біомаси.

5. Отримання товарної форми.

«Біофайл» - науково-інформаційний журнал

Сайт - Біохімія для студента

Біологічна хімія - Миколаїв А.Я. - Підручник

Структура і механізм дії ферментів - Фершт Е.