Тема №12

Мета заняття: вивчити серологічні реакції (реакцію аглютинації), техніку виконання і облік результатів

Матеріали та обладнання. сироватка крові, штатив із пробірками, спиця, пластина для РА.

Суть полягає в тому, що при додаванні сироватки крові, що містять специфічні антигену антитіла, в рівномірної суспензії клітин відбувається склеювання, освіту грудочок, грудочок, які поступово осідають на дно пробірки, формуючи характерний осад - агглютінати, рідина над ним прояснюється. Якщо антигеном є суспензія нерухомих бактерій (без джгутиків), що мають тільки соматичний О-антиген, утворюється дрібнозернистий осад протягом 16-22ч. Якщо антигеном служить суспензія бактерій, що мають джгутики (рухливі види), і в аглютинації бере участь поряд з соматичним ще жгутиковий Н-антиген, формується крупнохлопчатий, крупнозернистий агглютінати.

У ветеринарній практиці РА використовують для діагностики бруцельозу, сальмонельозу, колібактеріозу, лістеріозу, вібріозів, лептоспірозу та інших захворювань. Існує кілька методів постановки РА: пробірочний (об'ємний), крапельний (пластинчастий), кровяно-крапельний, гемаглютинації (РГА), гальмування гемаглютинації (РГГА), антіглобуліновой Кумбса, РА по Кастелані (метод адсорбції аглютинінів), кільцева проба з молоком.

Антигени полівалентна - мають кілька детермінантних рецепторів для зв'язку з антитілами і здатні вступати в реакцію з ними як в організмі тварини (in vivo), так і поза організмом - в пробірці (in vitro).

Антитіла - високомолекулярні білки глобулінової фракції сироватки крові (імуноглобуліни). За прояву феномена взаємодії між антигеном і антитілами in vitro розрізняють: осадові (прямі) реакції, лизирующие і нейтралізують. Антитіла, які беруть участь в осадових реакціях, отримали назву за своїм взаємодії з антигеном: аглютинінів-викликають склеювання корпускулярного антигену - аглютиноген і осадження комплексу антиген - антитіло (агглютіната); преціпітіни-утворюють преципітат з розчинною антигеном - преціпітіногеном.

Осадові серологічні реакції протікають в дві фази: перша фаза - специфічна, невидима простим оком, при ній відбувається утворення комплексу антиген - антитіло, в другій фазі - неспецифічної (фізико-хімічної) - проявляється кінцевий ефект - видимий результат, осадження агглютіната.

У ветеринарній та медичній практиці серологічні реакції як методи діагностики інфекційних хвороб застосовуються для: 1) визначення, виявлення (якісне і кількісне) антитіл в сироватці тварини за допомогою заздалегідь відомого антигену; 2) визначення специфічного антигену з використанням завідомо відомих специфічних гіперімунна сироваток (сибиреязвенная, сальмонельозні, бруцеллезние і ін.), Встановлення видової (варіантної) приналежності збудника хвороби, виділеного з досліджуваного матеріалу (серологічна ідентифікація).

Серологічні реакції застосовують також для оцінки природно і штучно набутого організмом тваринного імунітету. Серологічні реакції ставлять на фізіологічному розчині NaCl тому, що друга фаза їх протікає в слабоелектролітной середовищі.

Для визначення антитіл в сироватці крові (за відомим антигену) спочатку беруть кров (5 10 мл) з яремної вени тварини (у свиней з хвостовій) в стерильні пробірки і ставлять в тепле місце. Після утворення згустку його обережно відокремлюють від стінок пробірки, обводять стерильною металевим дротом (можна в'язальної спицею) і ставлять в холодне місце для ретракції. Сироватку відсмоктують в стерильні пробірки, останні нумерують і відправляють з нарочним і супровідним листом в лабораторію. У РА (як і взагалі при серологічних дослідженнях) використовують або свіжі сироватки без гемолізу, або консервовані фенолом, мертіолат, борною кислотою.

Антиген для РА є суспензія в фізіологічному розчині убитих або живих бактерій. Для діагностичних цілей необхідно користуватися стандартним антигеном. Якщо ж потрібно ідентифікувати бактеріальну культуру, виділену з патологічного матеріалу, застосовують стандартні сироватки, а антиген готують з добової культури - змив з МПА.

Техніка постановки РА .1) У штатив ставлять 5 пробірок в ряд. Кількість рядів залежить від кількості проб сироваток, які надійшли для дослідження. Пробірки підписують, (нумерують) олівцем по склу. 2) Готують основне розведення кожної досліджуваної сироватки, а також контрольних - позитивної і нормальної сироваток тварин (наприклад, ВРХ). Для цього в 1-у пробірку ряду вносять 2,4 мл фізрозчину і додають 0,1 мл сироватки (1:25). 3) Готують робочі розведення кожної проби сироватки: в 3-ю, 4-ю, 5-ю пробірки всіх рядів вносять по 0,5 мл фізрозчину. Потім з першої пробірки мірної піпеткою (за допомогою «груші») переносять в другу і третю пробірки по 0,5 мл основного розведення сироватки. У третій пробірці внесену сироватку змішують з перебувають в ній фізрозчином (виходить розведення 1:50). З третьої пробірки 0,5 мл сироватки переносять в четверту, змішують (розведення стає 1: 100) і 0,5 мл переносять в п'яту пробірку (розведення 1: 200). З останньої пробірки 0,5 мл розведеної сироватки виливають в банку з дезрозчином. Таким чином, у другій, третій, четвертій і п'ятій пробірках залишилося по 0,5 мл сироватки крові, розведеної відповідно 1:25, 1:50, 1: 100 і 1: 200, тобто отримали послідовні дворазові розведення кожної проби сироватки. 4) У пробірки з розведеними сироватками вносять антиген, попередньо розведений фізіологічним розчином NaCl до потрібної концентрації (єдиний бруцеллезний антиген розводять 1: 10- 1 млрд мікробних тіл в 1 мл), вносять його градуйованою піпеткою в кількості 0,5 мл в кожну пробірку. В результаті кінцеві розведення сироватки стають в 2 рази більше (концентрація в 2 рази менше) - відповідно 4. 50,1. 100, 1. 200, 1. 400, а в кожній дослідній пробірці загальний обсяг компонентів становить 1 мл. В першу пробірку антиген не додають, вона служить контролем якості досліджуваної сироватки. Компоненти при постановці РА вносять в пробірки окремими (індивідуальними) мірними пипетками (користуючись гумовими грушами) або груповими дозаторами. Після додавання до піддослідним і контрольним сироватка антигену Штативи з пробірками обережно струшують і поміщають в термостат на 16-20 год (37-38 ° С), потім 1-2 год витримують при кімнатній температурі, після чого враховують реакцію аглютинації.

Облік РА проводять неозброєним оком (візуально) або за допомогою агглютіноскопа в кожній пробірці, починаючи з контрольних. При наявності пластівців, фібрину, еритроцитів і сторонніх домішок в першій пробірці досвідченого ряду РА не враховують. Результати РА визначають в хрестах за наступною схемою:

++++(#) - повне просвітлення рідини над повністю осілим на дно пробірки агглютіна тому у вигляді розкритої перевернутого білого мереживного парасольки. При струшуванні парасольку раз-Біван на пластівці і грудочки, а рідина залишається прозорою. Прийнято вважати, що сталася 100% -ва аглютинація

+++ (+++) - неповне просвіта рідини, але добре виражений парасольку (75% -ва аглютинація). При струшуванні агглютінати розбивається на пластівці, грудочки, грудочки; рідина трохи каламутна;

++ (Два хреста) - помітне просвітлення рідини, парасольку помірно виражений (50% -ва аглютинація), при струшуванні осад розбивається на більш дрібні грудочки і грудочки, рідина каламутна;

(+) - ледь помітне просвітлення рідини, парасольку слабо виражений, при струшуванні осад розбивається на невелику кількість пластівців і грудочок (25% -ва аглютинація), рідина явно каламутна;

- (мінус) - просвітлення рідини і утворення парасольки відсутні, на дні пробірки в центрі видно «пунктика або« гудзик »- компактний осад клітин (мікробів) антигену які при струшуванні розбиваються в рівномірну каламутну суспензія.

Показники аглютинації в пробірках на два, три або чотири хрести характеризуються як позитивна реакція. Останнє розведення сироватки, в якому спостерігається аглютинація з оцінками на два, три і чотири хрести, вважають її титром. Діагностичну оцінку реакції аглютинації проводять з урахуванням вираженості в хрестах і по висоті її титрів (при різних хворобах по-різному).

У серологічної діагностиці є ще варіанти постановки РА - реакція мікроаглютинації. коли результат враховують в роздавленою краплі рідини на предметному склі під мікроскопом. Краплю піпеткою беруть з пробірки, в якій поєднані сироватка і антиген. Практичне застосування ця реакція знайшла в діагностиці лептоспірозу, сироватку готує біопромишленності. Випускають її в сухому (ліофілізованому) вигляді.

У ветеринарії реакція Кумбса розроблена для діагностики бруцельозу великої рогатої худоби у вигляді бактеріального варіанту.

Методика постановки реакції Кумбса. Компоненти реакції; бруцеллезний антиген (відмитий фізрозчином 2-3-кратним центрифугуванням), випробувана сироватка великої рогатої худоби, антиглобулінова сироватка. Попередньо ставлять звичайну РА в чотирьох розведеннях досліджуваної сироватки 1: 50-: 400. Чи враховують результат, потім визначають граничний титр. Пробірку з сироваткою граничного титру відставляють, а вміст наступних пробірок досліджують на наявність неповних антитіл: в ці пробірки додають по 2 мл фізрозчину, вміст кожної пробірки переносять у центрифужні пробірки, центрифугують при 4000 об / хв, надосадову рідину видаляють, осад ресуспен-діруют. 2 мл фізрозчину знову центрифугують при тих же умовах. Після другого відмивання і видалення надосадової рідини осад ресуспендіруют в 1 мл антіглобуліновой сироватки (в робочому титрі), суміш поміщають в термостат на 18 год (37 ° С), потім залишають на 2-4 год при кімнатній температурі, після чого враховують результат, як при звичайній РА. Мінімальний робочий титр реакції Кумбса при бруцельозі великої рогатої худоби враховується) 1: 200, 1: 100 вважається сумнівним результатом.