Приготування постійних препаратів з дорослих гельмінтів, їх фрагментів та яєць, паразити організму

Для підвищення кваліфікації в області лабораторної діагностики гельмінтозів потрібно вивчення морфології гельмінтів. Мікроськопістов навчають на свіжих і постійних препаратах. Свіжі препарати мають перевагу, що полягає в легкості виготовлення препарату, але вони мають і значний недолік: період їх дослідження обмежений. Крім того, в свіжих препаратах не завжди досить чітко виявляються деякі морфологічні деталі.
Постійні мікроскопічні препарати готують із цілих гельмінтів невеликого розміру, з окремих частин великих гельмінтів і з яєць гельмінтів. Постійні препарати бувають забарвлені і нефарбовані, з попередньої фіксацією і нефіксовані.

Постійні препарати нефарбовані, без попередньої фіксації

Такі препарати готують із зрілих члеників великих цестод для вивчення будови матки, заповненої яйцями.
Техніка виготовлення препаратів полягає в наступному. Кінцева частина стробіли бичачого і свинячого ціп'яків або широкого лентеца поміщається в холодну воду на 1-2 діб. Воду необхідно міняти 4-5 разів. За цей період часу спастически скорочені членики розправляються, відбувається деяка мацерація, вони стають м'якими і легко піддаються подальшій обробці. Потім стробілов розрізають ножицями по межі з'єднання члеників. У бичачого і свинячого ціп'яків членики відокремлюють по одному, а у широкого лентеца - по 3-4 членика '. Препаровальной голкою, не пошкоджуючи.

При виготовленні препаратів з зрілих члеників свинячого ціп'яка необхідно дотримуватися обережності, ретельно стежити, щоб онкосфери не потрапили на руки. Після маніпуляцій з цими члениками слід добре вимити руки і простерилізувати весь посуд і інструменти.
тканину членика, їх переносять на предметне скло, укладають уздовж скла, розправляють, перевіряють, чи немає бульбашок повітря під члеником. Для видалення бульбашок треба провести по членика голкою, тримаючи її паралельно склу та злегка натискаючи на членик. Надлишки води на склі навколо членика видаляють фільтрувальної папером.
Висушування члеників відбувається при кімнатній температурі за 18-24 год. Коли членики висохнуть, необхідно обережно обтерти скло, якщо на ньому залишилися сліди висохлої рідини. На сухих члениках має бути чітко видно будову матки. З метою збереження препаратів їх закладають в бальзам. Для цього на кожен членик, присохлий до скла, наносять рідкий бальзам (канадський або смерековий) і накладають покривне скло, розмір якого повинен відповідати розміру препарату. Бальзам висихає повільно, протягом 10-15 днів.

Постійні препарати фіксовані, нефарбовані

Ці препарати готують з сколексов великих цестод, з тріхінеллезного м'яса. Фіксацію сколексов великих цестод (бичачого або свинячого ціп'яків) виробляють одночасно з легким пресуванням.
Головки виділених цестод відрізають від стробіли разом з невеликою ділянкою шийки. Для приготування препаратів можуть бути використані вивернуті фіни, в цьому випадку капсулу фіни відрізають. Сколекси по 5-7 штук укладають на предметне скло в один ряд, накривають іншим предметним склом, злегка притискають і зав'язують ниткою.
Скло зі сколексами занурюють в 70 ° спирт на 12-24 год. За цей період відбувається фіксація і сколекси стають плоскими, добре бувають видно присоски, а також гаки на сколексе свинячого ціп'яка. Якщо фіксацію в спирті виробляти без пресування, то головки стискаються, набувають округлу форму і після подальшої обробки не розправляються. На таких препаратах погано бувають видно присоски, гаки на хоботке свинячого ціп'яка розташовуються близько один до одного.

За цією ж методикою готують препарати з тріхінеллезного м'яса. Шматочки м'язової тканини, зараженої личинками трихінел, препаровальной голками розщеплюють уздовж волокон на дрібні частинки. Шматочки м'язів укладають на предметне скло, закривають іншим предметним склом і злегка притискають, а потім обидва скла пов'язують ниткою і занурюють в 70 "спирт на 12-24 год. Якщо фіксацію м'язів провести без пресування між стеклами, тканину в спирті стискається і в препаратах будуть погано помітні личинки трихінел.
Після закінчення фіксації скла зі сколексами і шматочками тріхінеллезного м'яса витягають зі спирту, розв'язують нитки і з поверхні стекол обережно препаровальной голкою знімають спресовані сколекси і шматочки м'язової тканини в 70 спирт. Зневоднення виробляють в спиртах висхідної фортеці, поміщаючи матеріал з 70 ° в 80 °, потім в 96 ° і ще раз в 96 ° спирт, витримуючи в кожному з них по 5 хв. Перекладання з бюкса в бюкс треба робити обережно і брати препаровальной голкою або маленьким пінцетом за самий край шматочка тканини, а сколекси захоплювати за вільний кінець шийки.
Після зневоднення в спиртах препарати повинні бути просвітлені. З цією метою препарати послідовно проводять через карбол-ксилол, ксилол і ще раз ксилол (склад карбол-ксилолу: 1 частина фенолу і 3 частини ксилолу). У зазначених рідинах препарати повинні перебувати не більше однієї хвилини в кожної. Потім препарати містять в бальзам, для чого їх переносять на предметне скло в нанесену на нього краплю бальзаму і накривають покривним склом. Закривати склом слід обережно, підводячи його до краплі бальзаму під кутом, щоб уникнути утворення бульбашок повітря. Готовий препарат висихає протягом 10-15 днів.

Постійні препарати, забарвлені без попередньої фіксації

Такі препарати готують з гермафродитних члеників великих цестод. Попередньо готують молочнокислий кармін, для чого 0,1-0,3 г карміну розчиняють в 100 мл 50% молочної кислоти.

Техніка приготування препаратів наступна. Частина стробіли виділеного гельмінта, що складається з гермафродитних члеників, витримують у водопровідній воді протягом 1-3 днів, потім поміщають в молочнокислий кармін на 4-6-12 год. Термін перебування в барвнику залежить від величини об'єкта. Якщо стробила тонка, то досить тримати в фарбі 4-5 ч, якщо стробила товста (наприклад, у бичачого ціп'яка), то фарбуватися вона повинна більш тривалий час.
Після фарбування стробила повинна бути добре промита, для чого посудину з вміщеній туди стробілов зав'язують марлею і переносять під струмінь водопровідної води. Марля в даному випадку необхідна для того, щоб струмінь води не змила препарат. Промивати потрібно не менше години. Після закінчення промивання стробілов розрізають ножицями на окремі шматочки по 2-3 членика в кожному, розкладають на предметні скельця і ​​залишають для висихання на 6-12 год. Сухі членики заливають бальзамом і накривають покривним склом.

Постійні препарати фіксовані і пофарбовані

Ці препарати готують з дрібних трематод або цестод, а також з гермафродитних члеників великих цестод.
Попередньо готують барвник - солянокислий кармін. Для цього беруть 5 г карміну, розтирають у ступці з 5 мл соляної кислоти і 5 мл дистильованої води. Ретельно розтерту суміш залишають на годину. Потім з ступки кармін переносять у флакон і додають 200 мл 90 ° спирту, суміш поміщають на водяну баню до повного розчинення карміну, приблизно на 1 - 1,5 год. За цей час частина спирту випаровується, тому після закінчення розчинення карміну додають у флакон спирт тієї ж фортеці до початкового об'єму. Солянокислий кармін зберігають в добре закупореній посудині тривалий час.
Техніка фіксації і забарвлення препаратів наступна. Свежевиделенние трематоди або цестоди витримують у воді: дрібні об'єкти 3-4 ч, великі -6-12 ч. Потім гельмінти розкладають на предметному склі, накривають його іншим і перев'язують скла ниткою. Препарати переносять в 70 ° спирт на 1-2 ч (дрібні об'єкти) або 6-12 год (великі об'єкти).
Після закінчення фіксації гельмінти обережно знімають зі скла і занурюють в солянокислий кармін на термін від 30 хв до 1 год в залежності від величини об'єкта.
Витягнуті з солянокислого карміну гельмінти пофарбовані в інтенсивно червоний колір. Для видалення надлишків фарби і виявлення деталей будови гельмінти переносять в солянокислий спирт (на 100 мл 80 ° спирту додають 2-3 краплі соляної кислоти) на 5-10 хв. Після того як стануть добре помітними насінники, яєчники та інші деталі будови, препарати переносять в чистий 80 ° спирт.
З метою подальшого зневоднення досліджувані об'єкти переносять в 96 ° спирт, двічі міняючи порції. У бюксах зі спиртами гельмінти повинні знаходитися не менше 5-7 хв. Після цього об'єкти проводяться через карбол-ксилол і двічі через ксилол.
У бюксах з ксилолом об'єкти повинні знаходитися не більше 1-2 хв. Перенесений зі спирту в бюкс з кар- бол-ксилолом, гельмінт плаває на поверхні. Тому препаровальной голкою або пінцетом його потрібно обов'язково занурити на дно бюкса. Після проведення гельмінта через ксилоли його переносять на предметне скло, на якому нанесені 1-2 краплі бальзаму. Добре розправивши препарат, зверху наносять ще 1-2 краплі бальзаму і обережно закривають покривним склом.

Приготування постійних препаратів, укладених в гліцерин-желатину

Такі препарати готують з дрібних нематод і трематод. Техніка виготовлення наступна. Свежевиделенние гельмінти поміщають в воду на 3-4 ч для промивання. Після цього нематоди піддають подальшій обробці, а трематоди, що мають плоске тіло, повинні бути спресовані і зафіксовані так само, як це зазначалося в розділі приготування фіксованих препаратів з трематод.
Промиті нематоди і розправлені трематоди послідовно проводять через суміші спирту різної міцності і гліцерину. Зазначені суміші повинні бути приготовані заздалегідь і зберігаються в добре закупорених флаконах.

Готують їх за такою прописи:
1-я суміш -20 мл 40 ° спирту і 2 мл гліцерину
2-я »-20» 50 ° »і 5» »
3-тя »-20» 60 ° »і 6» »
4-я »- 20» 70 ° »і 10» »
У кожній із зазначених сумішей гельмінти витримують по 24 год. Посудина з останньої сумішшю через 24 ч відкривають для того, щоб спирт випарувався. Когда количество жидкости в бюксе уменьшится на одну треть, гельминты оказываются почти в чистом глицерине, откуда их извлекают по одному экземпляру на предметное стекло. За допомогою фільтрувальної 'паперу або марлі обережно видаляють надлишок гліцерину.
На розправлені гельмінт наносять розплавлену гліцерин-желатину, обережно накривають покривним склом і злегка притискають. Якщо гліцерин-желатину виступила за межі покривного скла, її видаляють після того, як вона застигне. Надлишки гліцерин-желатину зрізають бритвою або скальпелем, предметне скло витирають ганчіркою, змоченою теплою водою. Щоб запобігти висиханню препарату і зберегти його тривалий час, краю покривного скла окантовують рідким бальзамом.

Заливают 2 г сухой желатины 12 мл дистиллированной воды и оставляют на несколько часов до тех пор, пока желатина разбухнет. Потім посудину з набряклої желатиною поміщають на водяну баню. Необходимо все время помешивать стеклянной палочкой. Після повного розчинення желатину до неї додають 7 мл чистого гліцерину. Для попередження розвитку цвілі до розплавленої гліцерин-желатині додають кілька крупинок фенолу. Потім її проціджують через два шари марлі. Зберігають гліцерин-желатину в закупореній посудині. Перед вживанням суміш розплавляють на водяній бані.

Приготування постійних препаратів з яєць гельмінтів

Для приготування постійних препаратів свежевиделенние яйця не придатні. Вони повинні бути попередньо витримані в гліцерині. Суспензія яєць в гліцерині повинна буть концентрованої, щоб в невеликій краплі була достатня кількість яєць.
Яйця гельмінтів отримують двома способами: а) виділяють з матки дорослих гельмінтів і б) збирають з фекалій, застосовуючи методи збагачення.
Яйця з матки дорослих гельмінтів виділяють з цілий отримання яєць трематод, онкосфер бичачого ціп'яка, яєць широкого лентеца і гостриків. Дорослі трематоди або гострики, зрілі членики бичачого ціп'яка або широкого лентеца поміщають в годинне скло. Препаровальной голками розривають область матки. З піпетки на розірвану частина гельмінта наносять кілька крапель фізіологічного розчину для змивання яєць. Рідина збирається на дні скла. Уривки гельмінта видаляють.
Після осідання яєць на дно годинного скла, що відбувається протягом 15-20 хв, поверхневий шар рідини видаляють, а до осаду додають 50% водний розчин гліцерину, в якому яйця до приготування препаратів витримують не менше 7-10 днів. Сохранение их в глицерине более длительное время (месяцы и даже год) не отражается на структуре яиц.
Яйця власоглава, щурячого ціп'яка, шистосом, незапліднені яйця аскарид збирають з фекалій осіб, заражених тим чи іншим видом гельмінта, застосовуючи методи збагачення (збір яєць з плівки по методу Фюллеборна або Калантарян). Отримані таким чином яйця відмивають від солі і зберігають в 50% розчині гліцерину. Постійні препарати не можна приготувати з яєць анкилостомид, тріхостронгілід, карликового ціп'яка, запліднених яєць аскариди.
З метою виготовлення постійного препарату на предметне скло за допомогою загостреної сірники наносять краплю суспензії яєць. Для укладення в гліцерин-желатину можна скористатися одним з двох способів.
1. На краплю суспензії яєць, нанесену на предметне скло, опускають краплю розплавленої гліцерин-желатину і накривають покривним склом. Жидкость под стеклом должна распределиться равномерно.
2. На покривне скло, яке тримають за один куточок, скляною паличкою наносять рівномірний шар розплавленої гліцерин-желатину. Потім це скло під кутом підводять до краплі суспензії яєць, що знаходиться на предметному склі, і обережно опускають. Яйця і гліцерин-желатину, як і в попередньому випадку, повинні рівномірно розподілитися між стеклами.
Необхідно пам'ятати, що гліцерин-желатину швидко застигає, тому всі маніпуляції з нею треба робити по можливості швидко.
Основні дефекти, які можуть виникнути в процесі виготовлення препаратів, такі.
A. Гліцерин-желатину в повному обсязі зайняла простір між стеклами або утворилися бульбашки повітря. Це може статися через малу кількість взятої гліцерин-желатину. Усунути цей недолік можна, треба зробити новий препарат.
Б. Гліцерин-желатину застигла і не розтеклася між стеклами. В такому випадку необхідно скло трохи підігріти до розплавлення желатин, після чого вона розтечеться між стеклами.
B. На краплю суспензії яєць нанесено занадто багато гліцерин-желатину і вона вийшла за межі покривного скла.
Препарат треба перевірити під мікроскопом, і якщо яка виступила за межі скла гліцерин-желатину захопила яйця гельмінтів і під покривним склом їх не залишилося, то препарат треба зробити знову. Якщо ж під покривним склом залишилася достатня кількість яєць, то після того, як желатину застигне, видаляють її надлишки тим же способом, як це було описано в попередньому розділі.
Правильно приготовлений препарат повинен мати такий вигляд: покривне скло щільно прилягає до предметного, гліцерин-желатину заповнює весь простір між стеклами і не виступає за межі покривного скла. Для запобігання висихання препарату його окантовують рідким бальзамом. Напис на препараті з позначенням виду гельмінта або яєць роблять чорнилом по склу.

Приготування чорнила по склу

Розчиняють 1 г основного фуксину в 15 мл 96 ° спирту. Для кращого розчинення зазначена суміш повинна постояти в закупореній посудині добу. В іншому флаконі розчиняють 2 г таніну світлого кольору в 15 мл дистильованої води. Розчиняти таннин слід при легкому підігріванні. Коли таннин повністю розчиниться, розчин треба профільтрувати через фільтрувальний папір. Остиглий розчин таніну зливають з розчином фуксину і чорнило готові. Зберігають їх у добре закупореній посудині. Написи зручно робити тонким пером.